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表面微生物（擦拭法）的验证方案

[所属分类:技术资料] [发布时间:2019-12-16] [发布人:] [阅读次数:] [返回]

山东拓普生物工程有限公司

Shandong Tuopu Biol-Engineering Co.,Ltd　

表面微生物棉签擦拭法

验证方案

文件编号: TS-VD-4001A-2018

文件类别：验证

有限公司

验证方案批准

方案起草	签名	日期
质量部

方案审核	签名	日期
QC微生物组长
QA
质量部负责人

方案批准	签名	日期
验证领导小组负责人

验证小组人员名单

组长
姓名	职务/职称	部门

成员
姓名	职务/职称	部门

目录

1.验证概述……………………………………………………………………………2

1.1概述……………………………………………………………………………2

1.2验证目的………………………………………………………………………2

1.3验证范围………………………………………………………………………2

1.4引用标准………………………………………………………………………2

1.5验证条件………………………………………………………………………2

1.6验证文件………………………………………………………………………2

2.职责…………………………………………………………………………………3

2.1验证小组………………………………………………………………………3

2.2职责……………………………………………………………………………3

3.验证时间进度………………………………………………………………………3

4.验证程序及内容……………………………………………………………………3

4.1验证前准备……………………………………………………………………3

4.2验证试验………………………………………………………………………4

5.异常情况处理………………………………………………………………………6

6.再验证………………………………………………………………………………7

7.验证结论及评价……………………………………………………………………7

8.验证报告批准书……………………………………………………………………8

9.附件…………………………………………………………………………………9

文件检查表

培训检查表

计量器具校验表

验证项目确认表

验证用物品、菌种及培养基稀释液

需氧菌、霉菌和酵母菌的计数验证的测定结果

1. 验证概述：

1.1概述：

生产设备、容器具、工作台等需清洁，清洁后残留物限度经检验应符合要求，检验残留物限度有两种方法：一是最终淋洗水取样；二是擦拭取样。擦拭取样优点是能对最难清洁部位直接取样，通过考察有代表性的最难清洁部位的残留物限度评价设备、容器具、工作台等表面的清洁状况。但取样方法需验证其可行性。因此通过表面菌擦拭生长的菌落数与菌液浓度确认的菌落数比较，计算表面擦拭微生物回收率是否符合要求。以确定表面微生物擦拭取样、检测方法的可行性。

1.2验证目的：

本次验证中选用的擦拭对象为304不锈钢片，其材质与前处理车间、提取车间、水丸车间、口服固体制剂生产所用容器具、设备内表面、工作台表面材质相同。通过对表面微生物擦拭取样法的回收率试验，评价取样方法的有效性、代表性、科学性，并为证明检测表面微生物污染程度及清洁方法有效性提供基本依据。

1.3验证范围

本次验证适合容器具、设备内表面、工作台表面微生物擦拭取样法。

1.4参考标准

ISO14644 洁净室及相关受控环境

1.5验证条件

验证前，应首先对验证过程中使用的仪器、仪表及微生物限度检查的环境进行验证，洁净室的环境监测应符合要求；培养基适用性检查合格。

1.6验证执行的文件

微生物限度检查法 (SOP-QC-6017A)

培养基管理规程 (SMP-QM-2003A)

检定菌管理规程 (SMP-QM-2008A)

超净工作台、恒温培养箱、热压灭菌器等标准操作规程

偏差处理管理规程 (SMP-QM-1008A)

变更控制管理规程 (SMP-QM-1011A)

检验结果超标调查管理规程 (SMP-QM-2002A)

空气净化系统监测规程 (SMP-QM-1020A)

表面微生物监测标准操作规程 (SOP-QM-2010A)

2.职责

2.1验证小组

组长：质量管理负责人

成员：QC负责人、QA人员、QC人员、车间负责人、生产岗位操作人员

2.2职责

验证小组组长

保证方案和记录的起草

保证在执行前完成对方案和记录的审核和批准。

负责对验证小组成员进行本方案的培训。

确保完全按本方案实施。

确保能及时发现偏差，并按偏差处理规程进行记录、纠正、调查和最终确认。

验证过程中如有变更，执行变更控制管理规程。

确保报告的生成、审核和批准，以便对方案进行最终批准。

QA职责

执行前完成对方案及记录的审核。

负责验证过程的监控和检查，保证验证方案的实施，参与验证结果评价。

参与验证偏差的调查、处理和评估。

验证过程中，如有变更，执行变更控制管理规程。

其它成员职责

执行前确认方案已批准，并经过培训。

按验证方案实施验证，收集整理验证数据，完成验证记录和报告。

参与验证偏差的调查和处理，确认并通过偏差修订和解决方案。

3.验证时间进度

2018年月日----2018年月日	完成验证试验
2018年月日----2018年月日	数据汇总分析
2018年月日----2018年月日	完成验证报告

4.验证程序及内容

4.1. 验证前准备

4.1.1确认设备的相关标准操作规程和验证过程中用到的相关文件，将检查结果记录在文件检查表中，见附件1

4.1.2验证小组成员已进行该验证方案及相关标准操作规程的培训，将检查结果记录在培训

检查表中，见附件2

4.1.3 QA负责确认相关计量器具及检测设备已经过校验；验证所涉及的设施、设备、环境均以经过确认或验证。确认结果记录于附件计量器具校验确认表、验证检查表

4.1.4验证用物品

设备及器具，记录见附件

名称	规格型号	数量	使用地点
不锈钢载片	5cmⅹ5cm		微生物检测室
培养皿	Φ90mm		微生物检测室
脱脂棉签			微生物检测室
试管	21*180mm		微生物检测室
生化培养箱	SPX-400		培养室
蒸器灭菌器	MOST-T		准备室
铝制小盒、镊子、剪刀、医用止血钳

菌种

验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。

菌种类别	传代次数	菌种保藏现状
金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]
枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]
白色念珠菌[CMCC（F）98 001]

培养基及稀释液

名称	批号	配制批号	来源
胰酪大豆胨琼脂培养基
沙氏葡萄糖琼脂培养基
0.9%无菌氯化钠溶液

4.2验证试验

4.2.1菌液的制备

分别接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨琼脂培养基上，在30-35℃培养18~24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20-25℃培养48~72小时；上述培养物分别用0.9%无菌氯化钠溶液制成每0.1ml含菌数为50-100cfu（为提高实验准确度，便于表面擦拭菌落回收率计算，应尽量使工作菌液的理论含菌量接近100cfu）的菌悬液。

4.2.2供试液制备

4.2.2.1染菌不锈钢载片的制备

载片脱脂处理：载片放在含肥皂的水中煮沸30分钟，以纯化水洗净；然后用纯化水煮沸10分钟，冷却后用纯化水漂洗至PH中性晾干备用。

菌液滴染：将经灭菌的载片平铺于无菌平皿中，滴加金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的上述菌悬液1ml，并均匀涂布于整个载片表面。滴染菌液后，载片置超净工作台晾干后备用。每种菌平行制备两个染菌载片。

4.2.2.2擦拭取样

在数个试管中分别装10ml0.9%无菌氯化钠，加塞，121℃蒸汽灭菌30分钟；将棉签置于铝制小盒中与镊子一起121℃蒸汽灭菌30分钟。

供试液制备：用无菌棉签1支，用0.9%无菌氯化钠浸润后挤去多余的溶剂，以30度角平行擦拭表面，同时平稳而缓慢地移动棉签，往返擦拭5次；然后剪去手接触部分棉签；投入10ml0.9%无菌氯化钠中，密闭；同时编号注明名称、样品编号、取样人、取样日期等。

将装有样品的试管中，充分震荡洗脱，使棉签上的微生物释放到溶液中，作为供试液，于6小时内接种。

6个染菌载片用同法制备6份检品并编号。

4.2.3阴性对照液制备

用一支浸有0.9%无菌氯化钠的棉签按在未染菌的已灭菌载片上，以30度角平行擦拭表面，操作同供试液制备，平行制备两份，作为阴性对照。

4.2.4菌液计数

金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的菌液1ml（约50-100cfu）分别注入平皿中，立即倾入冷却至45℃左右的胰酪大豆胨琼脂培养基，倒置于30-35℃培养箱中，培养3天；取白色念珠菌的菌液1ml（约50-100cfu）分别注入平皿中，立即倾入冷却至45℃左右的沙氏葡萄糖琼脂培养基中，倒置于20-25℃培养箱中，培养5天。每株试验菌平行制备2个平皿，测定所涂布的试验菌数。

4.2.5验证方法

试验分别进行3次独立的平行试验，并分别计数各试验菌每次试验的菌回收率。

分别取充分混匀后的供试液1ml，放入平皿中，分别倾注培养基。金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌用胰酪大豆胨琼脂培养基，白色念珠菌用沙氏葡萄糖琼脂培养基。每株试验菌平行制备2个平皿。

分别吸取充分混匀后的阴性对照液1ml，放入平皿中，分别倾注胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基。每种培养基平行制备2个平皿。作为阴性对照。

将细菌培养皿倒置于30-35℃培养箱中，培养3天，霉菌酵母菌培养皿倒置于20-25℃培养箱中，培养5天，计数菌落数。

计算

表面擦拭菌落回收率计算公式

擦拭25cm²表面生长的菌落数

菌数回收率=———————————————————×100%

菌液确认平皿的平均菌落数

式中25cm²表面生长的菌落数：

即接种0.1ml（约50-100cfu）的菌液至25cm²灭菌载片上，经擦拭后两个平行检测皿中生长的菌落数的算术平均值乘以10；

菌液确认平皿的平均菌落数：

1ml（约50-100cfu）的菌液的两个确认平皿中生长的菌落数的算术平均值。

4.3可接受标准

阴性对照应无菌生长；

在3次独立的平行试验中，每种试验菌菌落回收率应大于50%。

4.4验证结果：见附件

5.异常情况处理

验证过程中严格按本方案的内容和项目进行，执行相关的标准操作规程。若验证过程中出现异常，应执行OOS调查管理规程、偏差处理管理规程或变更控制管理规程，调查分析原因采取措施，决定是否建立新的方法，修改验证方案重新验证。确保所有的变更得到评估和批准，验证的结果达到预定的目的和要求。

6.再验证：若原检验条件发生改变可能影响检验结果时，应重新验证。

7.验证结论及评价报告

1、是否按规程内容完成，如未按规程进行理由：批准人：
2、主要试验结果：阴性对照无菌生长，试验有效；三次独立平行试验中，载片的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌表面擦拭菌落回收率均在可接受标准范围内，且其三次验证平均回收率也在可接受标准范围内。
项目	标准	验证结果	是否符合规定
表面微生物棉签擦拭法验证
4、结果的分析、建议试验结果表明，采用该验证方法，可对不锈钢载片的表面菌进行有效的取样和检测，方法可行。报告人：年月日
5、会签重要试验结果是否完整：完整欠缺不合格试验结果可靠性：可靠尚需重试评价结果：合格不合格会签人：验证小组负责人：年月日

8.验证报告书批准

验证项目名称	表面微生物擦拭法验证
验证目的	通过对表面微生物擦拭取样法的回收率试验，评价取样方法的有效性、代表性、科学性，并为证明检测表面微生物污染程度及清洁方法有效性提供基本依据。
验证方案及验证报告编号	TS-VD-4001A-2016 TS-VD-4001AR-2016
该验证项目及验证报告已经审核无误，予以批准。特此证明。本验证项目有效期自年月日至止。验证管理部门负责人签字：年月日

企业盖章

9.附件

附件1：文件检查表

名称	存放地点	是否齐全
微生物限度检查法（SOP-QC-6017A）	档案室	□是 □否
培养基管理规程（SMP-QM-2003A）	档案室	□是 □否
检定菌管理规程（SMP-QM-2008A）	档案室	□是 □否
超净工作台、恒温干燥箱、蒸汽灭菌器等标准操作规程	档案室	□是 □否
偏差处理管理规程（SMP-QM-1008A）	档案室	□是 □否
变更控制管理规程（SMP-QM-1011A）	档案室	□是 □否
检验结果超标调查管理规程（SMP-QM-2002A）	档案室	□是 □否
空气净化系统检测规程（SMP-QM-1020A）	档案室	□是 □否
表面微生物监测标准操作规程（SOP-QM-2010A）	档案室	□是 □否
	档案室	□是 □否
	档案室	□是 □否
	档案室	□是 □否
	档案室	□是 □否

验证人：

日期：

附件2：培训检查表

培训日期	年月日
培训内容	《表面微生物棉签擦拭法验证》
培训人
培训结果评价方式	随机提问，根据接受培训者对内容的理解及问题回答的结果由评价人进行评价。评价结果分为合格、不合格。
验证小组人员培训情况
接受培训者	接受培训者签名		培训结果












培训效果确认
培训结果评价人		评价日期		年月日

附件3：计量器具校验表

检查内容	检查记录	是否合格
YP202N型电子天平	□有计量合格证并且在有效期内	□合格 □不合格
MOST-T型蒸汽灭菌器	□有计量合格证并且在有效期内	□合格 □不合格
GZX-DH-600BS-Ⅱ型电热恒温干燥箱	□有计量合格证并且在有效期内	□合格 □不合格
SPX-400型生化培养箱	□有计量合格证并且在有效期内	□合格 □不合格
GK-08A型超净工作台	□有计量合格证并且在有效期内	□合格 □不合格
	□有计量合格证并且在有效期内	□合格 □不合格
	□有计量合格证并且在有效期内	□合格 □不合格
	□有计量合格证并且在有效期内	□合格 □不合格
	□有计量合格证并且在有效期内	□合格 □不合格
	□有计量合格证并且在有效期内	□合格 □不合格

验证人：

日期：

附件4：验证检查表

内容	编号	存放地点
超净工作台确认报告	TS-VD-011AR03-2018
培养箱确认报告	TS-VD-021AR02-2018
电热恒温干燥箱确认报告	TS-VD-013AR02-2018
蒸汽灭菌器确认报告	TS-VD-023AR02-2018

检查人：日期：

附件5：验证用物品、菌种及培养基稀释液

设备及器具

名称	规格型号	数量	使用地点
不锈钢载片	5cmⅹ5cm
培养皿	Φ90mm
脱脂棉签
试管	21*180mm
生化培养箱	SPX-400
蒸汽灭菌器	MOST-T
铝制小盒、镊子、剪刀、医用止血钳

结论

检查人/日期复核人/日期

菌种

菌种类别	传代次数	菌种保藏现状
金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]
枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]
白色念珠菌[CMCC（F）98 001]

结论

检查人/日期复核人/日期

培养基及稀释液

名称	批号	配制批号	来源
胰酪大豆胨琼脂培养基
沙氏葡萄糖琼脂培养基
0.9%无菌氯化钠溶液

结论

检查人/日期复核人/日期

附件6：验证试验记录

细菌、霉菌的计数验证的测定结果（一）：

检测日期：年月日至年月日

细菌培养温度			霉菌培养温度
菌类	菌液名称	检品编号	平皿号	菌落数	平均菌落数	25cm²菌落数	菌数回收率
需氧菌	金黄色葡萄球菌



	枯草芽孢杆菌



霉菌和酵母菌	白色念珠菌



阴性对照	胰酪大豆胨琼脂培养基



	沙氏葡萄糖琼脂培养基



菌液组	金黄色葡萄球菌					----------

	枯草芽孢杆菌

	白色念珠菌

结果判定：

结论：

检测人：复核人：

质量管理负责人：

统计日期：

细菌、霉菌的计数验证的测定结果（二）：

检测日期：年月日至年月日

菌类	菌液名称	检品编号	平皿号	菌落数	平均菌落数	25cm²菌落数	菌数回收率
需氧菌	金黄色葡萄球菌



	枯草芽孢杆菌



霉菌和酵母菌	白色念珠菌



阴性对照	胰酪大豆胨琼脂培养基



	沙氏葡萄糖琼脂培养基

结果判定：

结论：

检测人：复核人：

质量管理负责人：

统计日期：

细菌、霉菌的计数验证的测定结果（三）：

检测日期：年月日至年月日

菌类	菌液名称	检品编号	平皿号	菌落数	平均菌落数	25cm²菌落数	菌数回收率
需氧菌	金黄色葡萄球菌



	枯草芽孢杆菌



霉菌和酵母菌	白色念珠菌



阴性对照	胰酪大豆胨琼脂培养基



	沙氏葡萄糖琼脂培养基

结果判定：

结论：

检测人：复核人：

质量管理负责人：

统计日期：

验证偏差和变更

偏差

变更

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