氯化钠内毒素方法验证

[所属分类:技术资料] [发布时间:2019-12-6] [发布人:] [阅读次数:] [返回]

山东拓普生物工程有限公司

Shandong Tuopu Biol-Engineering Co.,Ltd

审  批
	部门	姓名	签名	日期
起草人	质量检验部
审核人	质量检验部
审核人	品质管理部
审核人	品质管理部
批准人	质量负责人

分发部门：

  01品质管理部（1份）02质量检验部（1份）

共计2份

目 录

一、概述

二、确认目的与范围

三、确认方案编制依据

四、确认实施时间

五、确认成员和工作职责

六、确认前准备

七、确认内容与结果

八、漏项与偏差处理

九、评价与建议

十、确认结论

十一、确认记录与图谱

一、概述

氯化钠是我公司生产制剂的常用辅料，现质量检验部依据《分析方法确认与验证管理规程》（文件编码：F0004-01）、《中国药典》2015版四部相关规定和相应指导原则、现行版GMP规范要求，对氯化钠细菌内毒素方法进行确认，细菌内毒素系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法，公司采用凝胶法对供试品进行细菌内毒素检查干扰试验方法学验证，其中包括鲎试剂灵敏度复核试验、干扰预实验、正式干扰实验、样品细菌内毒素检查，证实该方法在公司现有实验室条件下检测数据的准确性和可靠性，保证该辅料检验的顺利实施。

二、确认目的与范围

本次验证方案主要适用于氯化钠质量控制所采用的细菌内毒素检查法的验证工作，目的在于通过验证证实氯化钠对两个厂家的鲎试剂进行干扰试验后，排除了干扰因素，均无干扰作用，通过真实可靠的检验数据确定在生产投料之前控制该原料的细菌内毒素，考察所采用的检验方法在本实验室条件下的适用性。

三、确认方案编制依据

《分析方法确认与验证管理规程》（文件编码：F0004-01）、《中国药典》2015版四部、《药品GMP指南》之《质量控制实验室与物料系统》、《药品GMP验证指南》、《药品生产质量管理规范》2010年版

四、确认实施时间

确认预计实施时间：自      年    月    日开始至      年    月    日完成。

五、确认成员与工作职责

根据公司验证委员会要求，对具体确认项目成立专项确认工作小组，负责该项目确认方案的起草、审核/审阅、批准，并组织实施、协调，负责确认结果记录与评定，负责完成确认报告。 

姓名	部门	工作职责
	质量检验部	负责起草验证文件
	质量检验部	负责审核验证文件，监督验证方案的实施
	品质管理部	负责相关文件的审核、归档，确保验证工作照章执行
	质量负责人	负责批准验证活动的执行

六、确认前准备

1 培训确认

序号	培训文件名称	编号	被培训人	培训方式	培训日期
1	《分析方法确认与验证管理规程》
2	《中国药典》2015版四部	——
3	细菌内毒素检查法操作规程
4	氯化钠质量标准

2 仪器与用具清单确认

设备名称	设备型号	设备编号	设备校验日期	有效期至
微型漩涡混合器
恒温试管加热仪
电热鼓风干燥箱

确认人/日期：                             复核人/日期：  

3 相关物料

试剂名称		批号	规格		生产厂家
鲎试剂(TAL)		1403051	0.125EU/ml		湛江博康海洋生物有限公司
鲎试剂(TAL)		1506231	0.125EU/ml		湛江安度斯生物有限公司
细菌内毒素工作标准(WSE)		150601-201580	80EU/支		中国食品药品检定研究院
细菌内毒素检查用水(BET)		1409040	5ml/支		湛江博康海洋生物有限公司
检查人				检查日期

确认人/日期：                             复核人/日期：  

4 检验方法

4.1依据的质量标准：《中国药典》2015版四部的要求，对测定方法进行验证。

4.2供试品：三批氯化钠，批号为201308271，201308272，201308273生产单位：湖北省八峰药化股份有限公司。

七、确认内容与结果

1试验方法：

试验分为鲎试剂灵敏度复核试验、干扰预实验、干扰正式试验，供试品细菌内毒素检查试验。

1.1 鲎试剂灵敏度复核试验：用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素工作标准品溶解，置漩涡混合器混合15min，等梯度制成2入、入、0.5入、0.25入，四个浓度（0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.0625 EU/ml），细菌内毒素溶液，按照《中国药典2010年版二部》附录XI E(细菌内毒素检查法)检查由湛江博康海洋生物有限公司、湛江安度斯生物有限公司，生产的0.25EU/ml的鲎试剂，当最大浓度2入管均为阳性，最低浓度0.25入管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验有效。

细菌内毒素溶液具体稀释步骤如下：

1.1.1 80EU/ml细菌内毒素溶液制备方法：取细菌内毒素标准品1支，用75%酒精棉球毒

瓶颈，开启安瓿，加入BET水1.0ml, 用封口膜封口,置漩涡混合器混合15min，即得80EU/ml细菌内毒素溶液。

1.1.2  8EU/ml细菌内毒素溶液制备方法：取80EU/ml细菌内毒素溶液0.2ml,加1.8mlBET水,混合30s，即得8EU/ml细菌内毒素溶液。

1.1.3  1EU/ml细菌内毒素溶液制备方法：取8EU/ml细菌内毒素溶液0.3ml，加2.1mlBET水混合30s, 即得1EU/ml细菌内毒素溶液。

1.1.4  0.5EU/ml细菌内毒素溶液制备方法：取1EU/ml细菌内毒素溶液2ml，加BET水2ml混合30s, 即得0.5EU/ml细菌内毒素溶液。

1.1.5  0.25 EU/ml细菌内毒素溶液制备方法：取0.5EU/ml细菌内毒素溶液2ml，加2mlBET水混合30s, 即得0.25EU/ml细菌内毒素溶液。

1.1.6  0.125EU/ml细菌内毒素溶液制备方法：取0.25EU/ml细菌内毒素溶液2ml，加2mlBET水混合30s, 即得0.125EU/ml细菌内毒素溶液。

1.1.7  0.0625EU/ml细菌内毒素溶液制备方法：取0.125EU/ml细菌内毒素溶液2ml，加2mlBET水混合30s, 即得0.0625EU/ml细菌内毒素溶液。

1.1.8 鲎试剂溶液的制备及加样：取0.1ml/支规格的鲎试剂18支，插在试管架上排成5列，其中前4列每列4支，第5列为2支，按标示量加入内毒素检查用水0.1ml复溶，然后从高到低依次加入0.1ml内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1mlBET水作为阴性对照，检查结果如表1。

鲎试剂灵敏度复核结果表1

TAT批号	标示灵敏度 （入）EU/ml	内毒素浓度（EU/ml）																	灵敏度（入c）EU/ml
		0.5				0.25				0.125				0.0625				NC
湛江博康海洋1403051	0.25
安度斯1506231	0.25
备注：阴性用“-”表示，阳性用“+”表示。

检查人/日期：                                                  复核人/日期：

 

结论：

                                                         评价人：    日期：

1.2 干扰试验

供试品细菌内毒素限值的确定：每1g氯化钠中含内毒素的量不得过5EU。

供试品的最小稀释浓度，按《中国药典2010年版二部》附录（XI E）细菌内毒素检查法中计算公式：供试品为注射用原料药，可计算最小有效稀释浓度c=入/L，供试品最小浓度25mg/ml,并考虑到目前市售鲎试剂有0.5、0.25、0.125、0.06、0.03五个灵敏度，则有效稀释浓度为100mg/ml～0.6 mg/ml

1.2.2干扰试验预试验

      用BET水分别将氯化钠各批样品分别稀释配制成浓度为15 mg/ml、25mg/ml、35mg/ml、45mg/ml,的系列稀释液（记为NPC管），另制备同样浓度的供试液，并使每一浓度的样品溶液均含有2入的内毒素（ 记为PPC管），选择两个不同生产厂家鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂，每一浓度分别取0.1ml，加入盛有0.1ml鲎试剂的试管中，每一浓度做2管，同时设阴性对照管（NC），阳性对照管（PC）,轻轻混匀，封口，按照《中国药典2010年版二部》附录XI E(细菌内毒素检查法)依法检查结果见表2-1，表2-2。

供试液的制备具体步骤如下：

1.2.2.1  称取供试品0.5g，到5mlBET中，混匀，即得100mg/ml氯化钠溶液，备用。

1.2.2.2  15mg/ml：取100mg/ml供试品溶液0.5ml，到1.2mlBET中，混匀，从中再取1.5ml混合液加BET1.5ml备用。

1.2.2.3  25mg/ml：取100mg/ml供试品溶液1ml，到1mlBET中，混匀，从中再取1.5ml混合液加BET1.5ml备用。

备用。

1.2.2.4  35mg/ml：取100mg/ml供试品溶液0.5ml，到0.9mlBET中，混匀，备用。

1.2.2.5  45mg/ml：取100mg/ml供试品溶液0.5ml，到0.6mlBET中，混匀，备用。

1.2.2.6 PPC溶液的制备：取0.25EU/ml细菌内毒素溶液0.3ml,加2倍各浓度下供试品0.3ml,混合30s，即得PPC溶液，备用。

氯化钠干扰预试验结果表2-1

湛江博康海洋生物有限公司：lotNO. 1403051        入=0.125EU/ml
供试品			样品浓度（mg/ml）				NC	PC
			15mg/ml	25mg/ml	35mg/ml	45mg/ml
	反 应 结 果	NPC
		PPC
		NPC
		PPC
		NPC
		PPC
注：“+”表示阳性；“-”表示阴性

检查人/日期：                                                  复核人/日期：

氯化钠干扰预试验结果表2-2

湛江安度斯海洋生物有限公司：lotNO. 1506231        入=0.125EU/ml
供试品			样品浓度（mg/ml）				NC	PC
			15mg/ml	25mg/ml	35mg/ml	45mg/ml
201308271	反 应 结 果	NPC
		PPC
201308272		NPC
		PPC
201308273		NPC
		PPC
注：“+”表示阳性；“-”表示阴性

检查人/日期：                                                  复核人/日期：

 

结论：

 

                                                评价人： 日期：

 

8.4.3 干扰试验正式试验

为了最终确定是否存在干扰因素，进行以下正式干扰实验。取氯化钠用BET进行稀释，使其最终干扰实验浓度为25mg/ml（鲎试剂0.125 EU/ml）按《中国药典》二部附录中的“细菌内毒素检查供试品干扰试验”进行实验，结果见表3-1、3-2。

氯化钠干扰试验正式试验结果表3-1

湛江博康海洋生物有限公司：lotNO. 1403051        入=0.125EU/ml
供试品		内毒素浓度（EU/ml）					Es(EU/ml)		Et（EU/ml）
		0.5	0.25	0.125	0.06	NC
	反 应 结 果
BET水溶液
注：“+”表示阳性；“-”表示阴性

检查人/日期：                                                  复核人/日期：

氯化钠干扰试验正式试验结果表3-2

湛江安度斯生物有限公司：lotNO. 1506231        入=0.125EU/ml

供试品

内毒素浓度（EU/ml）

Es(EU/ml)

Et（EU/ml）

0.5

0.25

0.125

0.06

NC

反 应 结 果

BET水溶液

注：“+”表示阳性；“-”表示阴性

检查人/日期：                                                  复核人/日期：

结论：

                                                    评价人： 日期：

8.4.4 供试品的细菌内毒素检查

8.4.4.1取本品用BET水制成25mg/ml浓度稀释液，按《中国药典2010年版二部》附录（XI E）依法检查，每1g氯化钠中含细菌内毒素的量应小于5EU。

将3批样品分别用0.125Eu/ml的鲎试剂，按《中国药典2010年版二部》附录（XI E）依法检查

8.4.4.2可接受标准: 3批供试品管和阴性对照管均为阴性，供试品的阳性管及阳性对照管均为阳性。

8.4.4.3取氯化钠用BET进行稀释，使其最终干扰实验浓度为25mg/ml（鲎试剂0.25 EU/ml）按《中国药典》二部附录中的“细菌内毒素检查法”进行实验，结果见表4。 

供试品的细菌内毒素检查结果表4

湛江博康海洋生物有限公司：lotNO. 1403051        入=0.125EU/ml
供试品批号	供试品浓度	NPC	PPC	PC	NC
201308271	25mg/ml
201308272	25mg/ml
201308273	25mg/ml
注：“+”表示阳性；“-”表示阴性

检查人/日期：                                                  复核人/日期：

结论：

 

                                                评价人： 日期：

八、偏差分析（若有偏差，需进行分析，若无则不进行分析）

九、评价与建议

1、完成上述工作后，将结果整理汇总。以确认报告的形式来汇总确认的结果，并在报告中应按本方案加以核对和审查。审查的内容应包括

1.1检查主要的确认试验是否按计划完成。

1.2检查确认方案在实施过程中是否修改，修改的理由是否明确并有批准手续。

1.3重要试验结果的记录是否完整。

1.4确认结果是否符合设定的标准，对偏离标准的结果有否作过调查，是否需要进一步的补充试验。

2、拟订再验证周期：

当遇下列情况，应进行再验证（确认）。

2.1检验方法进行了修订。

2.2 制剂处方和工艺进行了变更。

3、根据确认结果，确认该产品检验标准操作规程的适用性

 

总结人：                       日期：

十、确认结论

 

批准人：                            日期：

十一、原始记录、图谱等附件