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丸剂微生物检验方法适用性验证通用模板
山东拓普生物工程有限公司
Shandong Tuopu Biol-Engineering Co.,Ltd
XXXX丸微生物限度检查方法适用性验证
检品信息
检品名称
XXXX丸
检品批号
规格
6g/丸
检验人
制剂单位
XXXX制剂中心
检验日期
检验依据
《中国药典》2015版四部通则1105非无菌药品微生物限度检查法
实验仪器
仪器编号
仪器名称
检定有效期
是否使用
YQ-JY-043
蒸汽压力灭菌器
2017年5月
是
YQ-JY-002
电子天平
2017年5月
是
YQ-JY-039
净化工作台
2017年5月
是
YQ-JY-023
生化培养箱
2017年5月
是
YQ-JY-024
霉菌培养箱
2017年5月
是
培养基
批号
培养基名称
配制日期
是否使用
151028
胰酪大豆胨琼脂培养基
2016年6月1日
是
20150710
沙氏葡萄糖琼脂培养基
2016年6月1日
是
151009
胰酪大豆胨液体培养基
2016年6月1日
是
20150916
麦康凯液体培养基
2016年6月1日
是
140312
麦康凯琼脂培养基
2016年6月1日
是
151125
肠道菌群增菌液培养基
2016年6月1日
是
151123
紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基
2016年6月1日
是
20150428
RV沙门菌增菌液体培养基
2016年6月1日
是
151214
木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基
2016年6月1日
是
151228
三糖铁琼脂培养基
2016年6月1日
是
实验用菌
阳性对照菌
菌种编号
菌种批号
传代数
是否使用
金黄色葡萄球菌
CMCC（B）26 003
J20160104-1-2(15)-6
3
是
铜绿假单胞菌
CMCC（B）10 104
T20160104-1-2(15)-6
3
是
枯草芽孢杆菌
CMCC（B）63 501
K20160104-1-2(15)-6
3
是
白色念珠菌
CMCC（F）98 001
B20160104-1-2(15)-6
3
是
黑曲霉菌
CMCC（F）98 003
H20160104-1-2(15)-6
3
是
大肠埃希菌
CMCC（B）44 102
D20160104-1-2(15)-6
3
是
乙型副伤寒沙门菌
CMCC（B）50 094
SM20160104-1-2(15)-6
3
是
1.实验方案：
本品为非无菌含药材原粉的中药固体口服给药制剂（不含豆豉、神曲等发酵原粉丸剂），非无菌微生物限度标准应为：
需氧菌数：不得过3×104cfu/g
霉菌酵母菌数：不得过102cfu/g
控制菌：大肠埃希菌（1g）不得检出；沙门菌（10g）不得检出；耐胆盐革兰氏阴性菌应小于102（1g）。
1.1验证试验目的
确认所采用的方法适用于本品的微生物限度检查，即确认本品在该检验量及该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除到可以忽略不计，保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。
1.2微生物限度检查方法
取本品10g，加入胰酪大豆胨液体培养基100ml，振摇至分散均匀，作为1:10供试液；取本品10g加入胰酪大豆胨液体培养基200ml，振摇至分散均匀，作为1:20供试液。取1:20供试液1ml注入无菌平皿中依法检查（《中国药典》2015版1105非无菌药品微生物限度检查法：微生物计数法）需氧菌总数。取1:10供试液1ml注入无菌平皿中，依法检查（《中国药典》2015版1106非无菌药品微生物限度检查法：微生物计数法）检查霉菌酵母菌总数。
取1:10供试液10ml，置胰酪大豆胨液体培养基100ml中，依法（《中国药典》2015版1106非无菌药品微生物限度检查法：控制菌检查法）检查大肠埃希菌。
取1:10供试液10ml，置胰酪大豆胨液体培养基100ml中，依法（《中国药典》2015版1106非无菌药品微生物限度检查法：控制菌检查法）检查耐胆盐革兰阴性菌。
取10g供试品置胰酪大豆胨液体培养基100ml中，依法（《中国药典》2015版1106非无菌药品微生物限度检查法：控制菌检查法）检查沙门菌。
2培养基适用性检查
2.1菌液制备
2.1.1 取经35℃培养24小时的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的大肠埃希菌的新鲜培养物各1ml，用0.9%无菌NaCl溶液10倍稀释，做活菌计数，备用。取经25℃培养48小时的白色念珠菌的新鲜培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释，做活菌计数，备用。
2.1.2 取经25℃培养5～7天的黑曲霉的新鲜培养物至，加入3~5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌NaCl溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管中取培养物1ml加9ml0.9%无菌NaCl溶液（含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80）十倍稀释至10－5做活菌计数备用。菌液制备后在常温下放置，并在2小时内使用。若保存在2-8℃，可在验证有效期内使用。
2.2计数培养基适用性检查
取上述金黄色葡萄球菌10-5稀释液、铜绿假单胞菌10-5稀释液、枯草芽孢杆菌10-5稀释液、大肠埃希菌10-5稀释液、白色念珠菌10-3稀释液及黑曲霉10-2稀释液各1ml，分别加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，分别取1ml，用45℃胰酪大豆胨琼脂培养基20ml注皿，平行测定两皿，35℃培养3天，计数，应不大于100cfu。再取白色念珠菌10-3稀释液及黑曲霉10-2稀释液各1ml，分别加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，分别取1ml，用45℃沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml注皿，平行测定两皿，25℃培养5天，计数，应不大于100cfu。同时用相应的对照培养基替代待测培养基进行上述实验。待测培养基的菌落平均数与对照培养基的菌落平均数比值应在0.5-2范围内，且菌落大小、形态特征应与对照培养基一致。试验结果见表1。
阴性对照：用胰酪大豆胨液体培养基替代供试液，立即倾注琼脂培养基，各平行测定两皿，待凝固后，胰酪大豆胨琼脂培养基平皿在35℃培养3天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平皿在25℃培养5天，应无菌生长。
表1 计数培养基适用性检查结果
菌种名称
培养基
活菌计数结果（cfu/ml）
待测培养基/对照培养基（%）
待测培养基
对照培养基
金黄色葡萄球菌
TSA
95
98
87
91
89
92
铜绿假单胞菌
TSA
91
86
87
87
86
98
枯草芽孢杆菌
TSA
92
85
98
95
97
85
白色念珠菌
TSA
93
95
88
96
85
92
黑曲霉
TSA
97
93
86
91
85
86
白色念珠菌
SDA
88
96
91
91
96
94
黑曲霉
SDA
93
85
97
87
87
92
菌落形态大小是否一致
待测培养基菌落形态与对照培养基菌落形态一致
结论：计数培养基适用性检查符合规定。
2.3控制菌检查用培养基适用性检查
2.3.1大肠埃希菌检查用培养基适用性检查
2.3.1.1阴性对照
用1ml胰酪大豆胨液体培养基替代大肠埃希菌增菌液加入麦康凯液体培养基中，置30-35℃温度培养，应无菌生长。
2.3.1.2麦康凯液体培养基促生长能力和抑制能力检查：
分别接种不大于100cfu的大肠埃希菌于被检查培养基和对照培养基中，在42℃培养24小时，与对照培养基比较，被检培养基管试验菌生长良好。接种不少于100cfu的金黄色葡萄球菌于被检查培养基和对照培养基中，在35℃培养72小时，试验菌应不得生长。
2.3.1.3麦康凯琼脂培养基促生长能力和指示特性：
用涂布方法分别接种不大于100cfu的大肠埃希菌于被检查培养基和对照培养基中，在35℃培养18小时，与对照培养基比较，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小形态特征一致，指示剂反应情况与对照培养基一致。
表2大肠埃希菌检查用培养基适用性检查结果
检测项目
培养基
实验用菌
促生长能力
抑制能力
指示能力
对照培养基
待测培养基
对照培养基
待测培养基
对照培养基
待测培养基
大肠埃希菌
麦康凯液体培养基
大肠埃希菌
+
+
/
/
/
/
金黄色葡萄球菌
/
/
-
-
/
/
麦康凯琼脂培养基
大肠埃希菌
+
+
/
/
+
+
*表中“+”表示有促生长能力，“-”表示有抑制能力，“/”表示不要求做。
结论：大肠埃希菌检查用培养基适用性检查结果符合规定。
2.3.2沙门菌检查用培养基适用性检查
2.3.2.1阴性对照
用1ml胰酪大豆胨液体培养基替代沙门菌增菌液加入RV沙门菌增菌液培养基，置30-35℃温度培养，应无菌生长。
2.3.2.2 RV沙门菌增菌液体培养基促生长能力和抑制能力检查
分别接种不大于100cfu的沙门菌于被检查培养基和对照培养基中，在35℃培养18小时，与对照培养基比较，被检查培养基管试验菌生长良好。
接种不少于100cfu的金黄色葡萄球菌于被检培养基和对照培养基中，在35℃培养72小时，试验菌应不得生长。
2.3.2.3木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基促生长能力和指示特性
用划线方法分别接种沙门菌培养物于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板和对照培养基平板中，在35℃培养18小时，与对照培养基比较，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小形态特征一致，指示剂反应情况与对照培养基一致。
2.3.2.4三糖铁琼脂培养基指示特性
用针挑取沙门菌培养物用斜面和高层穿刺法分别接种于三糖铁琼脂培养基高层斜面中和对照培养基高层斜面中，在35℃培养18小时，与对照培养基比较，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小形态特征一致，指示剂反应情况与对照培养基一致。
表3 沙门菌检查用培养基适用性检查结果
检测项目
培养基
实验用菌
促生长能力
抑制能力
指示能力
对照培养基
待测培养基
对照培养基
待测培养基
对照培养基
待测培养基
沙门菌
RV沙门菌增菌液体培养基
沙门菌
+
+
/
/
/
/
金黄色葡萄球菌
/
/
-
-
/
/
木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基
沙门菌
+
+
/
/
+
+
三糖铁琼脂培养基
沙门菌
/
/
/
/
+
+
*表中“+”表示有促生长能力，“-”表示有抑制能力，“/”表示不要求做
结论：沙门菌检查用培养基适用性检查结果符合规定。
2.3.3耐胆盐革兰阴性菌检查用培养基适用性检查
2.3.3.1阴性对照
用1ml胰酪大豆胨液体培养基替代大肠埃希菌增菌液加入肠道菌增菌液体培养基，置35℃温度培养，应无菌生长。
2.3.3.2肠道菌增菌液体培养基促生长能力和抑制能力检查：
分别接种不大于100cfu的大肠埃希菌于肠道菌增菌液体培养基和对照培养基中，在35℃培养24小时，与对照培养基比较，被检查培养基管试验菌生长良好。
接种不少于100cfu的金黄色葡萄球菌于被检培养基和对照培养基中，在35℃培养72小时，试验菌应不得生长。
2.3.3.3 紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基指示特性：
用划线接种大肠埃希菌培养物于被检查培养基和对照培养基中，在35℃培养18小时，与对照培养基比较，被检查培养基与对照培养基上生长的菌落大小形态特征一致，指示剂反应情况与对照培养基一致。
表4 耐胆盐革兰阴性菌检查用培养基适用性检查结果
检测项目
培养基
实验用菌
促生长能力
抑制能力
指示能力
对照培养基
待测培养基
对照培养基
待测培养基
对照培养基
待测培养基
耐胆盐革兰阴性菌
肠道菌增菌液培养基
大肠埃希菌
+
+
/
/
/
/
金黄色葡萄球菌
/
/
-
-
/
/
紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基
大肠埃希菌
+
+
/
/
+
+
*表中“+”表示有促生长能力，“-”表示有抑制能力，“/”表示不要求做。
结论：耐胆盐革兰阴性菌检查用培养基适用性检查结果符合规定。
3方法验证
3.1需氧菌检查方法适用性试验
3.1.1 供试液制备：取本品10g，加入胰酪大豆胨液体培养基100ml振摇至分散均匀，作为1:10供试液；另取本品10g，加入胰酪大豆胨液体培养基200ml振摇至分散均匀，作为1:20供试液。
3.1.2 实验组需氧菌总数计数（平皿法1ml/皿）
常规法：取含不大于100cfu/ml试验菌液的1:10供试液1ml，注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，各平行测定两皿，待凝固后，胰酪大豆胨琼脂培养基平皿在35℃培养3天，观察计数。
培养基稀释法：取含不大于100cfu/ml试验菌液的1:20供试液1ml，注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，各平行测定两皿，待凝固后，胰酪大豆胨琼脂培养基平皿在35℃培养3天，观察计数。
3.1.3 霉菌和酵母菌总数计数（平皿法1ml/皿）
取含不大于100cfu/ml试验菌液的1:10供试液1ml，注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，各平行测定两皿，待凝固后，沙氏葡萄糖培养基平皿在25℃培养5天，观察计数。
3.1.4 菌液对照组
取制备好的菌液，其余操作与实验组相同，测定上述制备好的菌液中每毫升的菌落数。
3.1.5 供试品对照组
取制备好的供试液，以稀释剂代替菌液，其余操作与实验组相同，测定供试品本底菌数。
3.1.6 回收率公式的计算
按如下公式计算实验组的加菌回收率
实验组的加菌回收率=[（实验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数]×100%
表5 需氧菌总数实验用菌液检验菌落计数结果
试验次数
试验方法
金黄色葡萄球菌10-5
铜绿假单胞菌10-5
枯草芽孢杆菌10-5
白色念珠菌10-3
黑曲霉10-2
1
平皿法
（1ml/皿）
88、92
87、93
95、91
87、82
89、83
2
平皿法
（1 ml/皿）
94、96
93、91
93、92
86、89
88、85
表6 需氧菌计数方法的验证（加菌回收率%测定结果）
试验次数
试验方法
金黄色葡萄球菌10-5
铜绿假单胞菌10-5
枯草芽孢杆菌10-5
白色念珠菌10-3
黑曲霉10-2
1
平皿法（1:10供试液1ml/皿）
23
54
20
93
95
培养基稀释法（1:20供试液1ml/皿）
70
90
71
95
96
2
平皿法（1:10供试液1ml/皿）
25
56
28
96
93
培养基稀释法（1:20供试液1ml/皿）
78
88
75
98
94
试验
次数
试验方法
白色念珠菌
黑曲霉
1
平皿法（1ml/皿）
91、93
88、89
2
平皿法（1ml/皿））
92、95
87、90
表8 霉菌及酵母菌计数法方法验证 (加菌回收率%测定结果)
试验
次数
试验方法
白色念珠菌
黑曲霉
1
平皿法（1:10供试液1ml/皿）
97
95
2
平皿法（1:10供试液1ml/皿）
93
98
从表5、表6结果可以看出，供试品接种5种阳性试验菌株，培养基稀释法（1:20供试液1ml/皿）对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率比值在0.5-2之间，故需氧菌总数用稀释法（1:20供试液1ml/皿）进行测定；常规平皿法（1:10供试液
1ml/皿）对白色念珠菌、黑曲霉菌的回收比值在0.5-2之间，故霉菌及酵母菌数采用平皿法（1ml/皿）进行测定。
3.2控制菌检查方法适用性试验
依据：《中国药典》2015版1106非无菌药品微生物限度检查法控制菌检查法
3.2.1大肠埃希菌方法验证
实验组：1:10供试液10ml及不大于100cfu/ml实验菌液1ml接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，35℃培养24小时。振摇容器，取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基42℃培养48小时。取麦康凯液体培养物划线接种至麦康凯琼脂培养基平板上，35℃培养72小时观察结果。
阴性对照组：以稀释剂替代供试液，不加菌液，其他操作同实验组，作为阴性对照，置规定温度培养后观察结果。
阳性对照组：不加供试液，其它操作同实验组，作为阳性对照，置规定温度培养后观察结果。
表9 大肠埃希菌检查法验证结果
试验次数
1
2
结果
实验组
+
+
检出
阴性对照组
-
-
未检出
阳性对照组
+
+
检出
从上述结果可以看出，大肠埃希菌采用常规法检查。
3.2.2沙门菌方法验证
实验组：取10g供试品及不大于100cfu/ml实验菌液1ml接种至100ml胰酪胨大豆液体培养基中，混匀，35℃培养24小时。振摇容器，取上述培养物0.1ml接种至10mlRV沙门菌增菌液体培养基35℃培养24小时。取培养物划线接种至木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，35℃培养48小时观察结果。
阴性对照组：以稀释剂替代供试液，不加菌液，其他操作同实验组，作为阴性对照，置规定温度培养后观察结果。
阳性对照组：不加供试液，其它操作同实验组，作为阳性对照，置规定温度培养后观察结果。
表10 沙门菌检查法验证结果
试验次数
1
2
结果
实验组
+
+
检出
阴性对照组
-
-
未检出
阳性对照组
+
+
检出
从上述结果可以看出，沙门菌采用常规法检查。
3.2.3耐胆盐革兰阴性菌
实验组：1:10供试液10ml及不大于100cfu/ml实验菌液1ml接种至100ml肠道菌増菌液体培养基中，混匀，35℃培养48小时。取上述培养物划线接种至紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，35℃培养24小时观察结果。
阴性对照组：以稀释剂替代供试液，不加菌液，其他操作同实验组，作为阴性对照，置规定温度培养后观察结果。
阳性对照组：不加供试液，其它操作同实验组，作为阳性对照，置规定温度培养后观察结果。
表11 耐胆盐革兰阴性菌
试验次数
1
2
结果
实验组
+
+
检出
阴性对照组
-
-
未检出
阳性对照组
+
+
检出
从上述结果可以看出，耐胆盐革兰阴性菌采用常规法检查。
4方法适用性试验结论：
上述验证实验结果证明，XXXX丸非无菌产品微生物限度检查方法可行。依据检验结果，制定本品微生物限度检查方法如下：
【检查】 取本品10g加入胰酪大豆胨液体培养基100ml，振摇至分散均匀，作为1:10供试液；取本品10g加入胰酪大豆胨液体培养基200ml，振摇至分散均匀，作为1:20供试液；
取1:20供试液1ml采用平皿法（1ml/皿）依法检查（《中国药典》2015版1105非无菌药品微生物限度检查法）需氧菌总数；
取1:10供试液1ml采用平皿法（1ml/皿）依法检查（《中国药典》2015版1105非无菌药品微生物限度检查法）霉菌和酵母菌数。控制菌大肠埃希菌、沙门菌、耐胆盐革兰氏阴性菌采用《中国药典》2015版1106非无菌产品微生物限度检查控制菌检查法检查。
本品微生物限度标准（含药材原粉的中药制剂丸剂）：需氧菌总数应不得过3×104cfu/g，霉菌酵母菌总数应不得过102cfu/g，大肠埃希菌(1g)应不得检出，沙门菌（10g）不得检出，耐胆盐革兰氏阴性菌应小于102（1g）。
表7 霉菌及酵母菌实验用菌液检验菌落计数结果
