2015年版中国药典BET法

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《中国药典》
2015年版BET法
2016年6月
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《中国药典》 2015年版BET法
综述
实验
BET
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四部通则1143
1.综述部分
• 细菌内毒素检查法的定义及方法学分类
• 细菌内毒素标准品和检查用水
• BET操作和器具的要求
• 供试品溶液的制备
• 内毒素限值的确定
• 最大有效稀释倍数和最小有效稀释浓度的
计算 3
2.实验部分
• 凝胶法
– 鲎试剂灵敏度复核试验
– 干扰试验
– 检查法
• 凝胶限度试验
• 凝胶半定量试验
• 光度测定法
– 标准曲线的可靠性
试验
– 干扰试验
– 检查法
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3.2015年版与2010年版ChPBET法主
要不同点

项目	2010年	2015年
仲裁方法	以凝胶法结果为准	以凝胶限度试验结果为准
操作要求	应防止微生物和内毒 素的污染”	应防止内毒素的污染”； 删除“微生物” 。 避免误解
细菌内毒 素国家标 准品用途	用于标定、复核、仲 裁鲎试剂灵敏度和标 定细菌内毒素工作标 准品的效价	用途增加：干扰试验及检 查法中编号 B 和 C 溶液的 制备、凝胶法中鲎试剂灵 敏度复核试验、光度测定 法中标准曲线可靠性试验。

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明确仲裁方法

项目	2010年	2015年
细菌内毒素 工作标准品 用途	用于试验中的鲎试剂灵 敏度复核、干扰试验及 各种阳性对照	用于干扰试验及检查法中 编号B和C溶液的制备、 凝胶法中鲎试剂灵敏度复 核试验、光度测定法中标 准曲线可靠性试验
供试品溶液 pH值的要求	供试品溶液的pH 值在 6.0～8.0的范围内	供试品溶液和鲎试剂混合 后溶液的pH 值在6.0～ 8.0的范围内
λ c计算公式	λc＝antilg （∑X / 4 )	λc=antilg（∑X/n）； n 为每个浓度的平行管数
干扰试验	方法：溶液C各平行4管	方法：溶液C各平行2管
判断：0.5λ≤Es≤2λ； 0.5Es≤Et≤2Es	判断：溶液C和溶液B的 结果，符合鲎试剂灵敏度 复核试验的要求。


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项目	2010年	2015年
凝胶半定量 结果判断	系列溶液A中每一系列平行 管的终点稀释倍数乘以λ，为 每个系列的反应终点浓度， 所有平行管反应终点浓度的 几何平均值即为供试品溶液 的内毒素浓度〔按公式 CE=antilg（∑X/2）〕。 若内毒素浓度小于规定的限 值，判定供试品符合规定。 若内毒素浓度大于或等于规 定的限值，判定供试品不符 合规定。	系列溶液A中每一系列的终点 稀释倍数乘以λ，为每个系列 的反应终点浓度，如果检验 的是稀释过的供试品，则将 终点浓度乘以供试品进行半 定量试验的初始稀释倍数， 即得到每一系列的内毒素浓 度C。 若每一系列内毒素浓度均小 于规定的限值，判定供试品 符合规定。 每一系列内毒素 浓度的几何平均值即为供试 品溶液的内毒素浓度〔按公 式CE=antilg（∑C/2）〕 。 若任何系列内毒素浓度不小 于规定的限值，则判定供试 品不符合规定。



项目	2010年	2015年
凝胶限度 试验	供试品溶液：稀释倍 数为MVD	供试品溶液：稀释倍数不 超过MVD
结果判断：/	增加：若供试品的稀释倍 数小于 MVD 而溶液 A 出 现不符合规定时，需将供 试品稀释至 MVD 重新实验 再对结果进行判断。
动态浊度 法定义	是检测反应混合物的 浊度到达某一预先设 定的吸光度所需要的 反应时间，或是检测 浊度增加速度的方法。	是检测反应混合物的浊度 到达某一预先设定的吸光 度或透光率所需要的反应 时间，或是检测浊度增加 速度的方法。

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项目	2010年	2015年
动态显色 法定义	动态显色法是检测反 应混合物的色度达到 某一预先设定的吸光 度所需要的反应时间， 或检测色度增长速度 的方法。	动态显色法是检测反应混 合物的吸光度或透光率达 到某一预先设定的检测值 所需要的反应时间，或检 测值增加速度的方法。
光度法结 果判断	当阴性对照的反应时 间大于标准曲线最低 浓度的反应时间	阴性对照的吸光度或透光 率小于标准曲线最低点检 测值或阴性对照的反应时 间大于标准曲线最低浓度 的反应时间；

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供试品溶液pH值的要求
2010年版
•一般要求供试品溶液的pH值
在6.0～8.0的范围内。对于过
酸、过碱或本身有缓冲能力的
供试品，需调节被测溶液（或
其稀释液）的pH值，可使用
酸、碱溶液或适宜的缓冲液调
节pH值。
2015年版
•必要时，可调节被测溶液
（或其稀释液）的pH值，一
般供试品溶液和鲎试剂混合
后溶液的pH值在6.0～8.0的
范围内为宜，可使用酸、碱
溶液或适宜的缓冲液调节pH
值。
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供试品溶液PH值的要求
鲎试剂本身具有缓冲能力，可以将大部分供
试品的pH值调节至6.0～8.0的范围内；
对于供试品pH值的调节不是必须的；
检测供试品溶液和鲎试剂1：1混合后溶液的
pH值
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凝胶法干扰试验结果判断方法
2010年版
只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴
性，并且系列溶液C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围
内时，试验方为有效。
按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平
均值（Es 和Et）。
Es=antilg（∑Xs/4）；Et=antilg（∑Xt/4）
式中Xs、 Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点
浓度的对数值（lg）。
当Es在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）及Et在0.5Es～
2Es（包括0.5Es和2Es）时，认为供试品在该浓度下
无干扰作用。 12
凝胶法干扰试验结果判断方法
2015年版
只有当溶液A 和阴性对照溶液D 的所有平行管都为阴
性，并且系列溶液C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验
的要求时，试验方为有效。
当系列溶液B的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验的要
求时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。
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凝胶法干扰试验结果判断方法
试验有效性的判断一致；
判为无干扰的条件不同；
2010年版：
• 0.5λ≤Es≤2λ；0.5Es≤Et≤2Es；
2015年版：
• 系列溶液B的结果符合鲎试剂灵敏度复核
试验的要求；
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平行 管数	溶液C（Es）
2λ	λ	½λ	¼λ
1	＋	＋	－	－
2	＋	＋	－	－
3	＋	＋	－	－
4	＋	＋	－	－
平行 管数	溶液B（Et）
SE2λ	SEλ	SE½λ	SE¼λ
1	＋	＋	－	－
2	＋	＋	－	－
3	＋	＋	－	－
4	＋	＋	－	－

最理想的无干扰状况，Et=Es。
表a
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平行 管数	溶液C（Es）
2λ	λ	½λ	¼λ
1	＋	＋	＋	－
2	＋	＋	＋	－
3	＋	＋	＋	－
4	＋	＋	＋	－
平行 管数	溶液B（Et）
SE2λ	SEλ	SE½λ	SE¼λ
1	＋	－	－	－
2	＋	－	－	－
3	＋	－	－	－
4	＋	－	－	－

不符合2010年版要求，但符合2015年版要求
表b
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2010年：
Es=½λ;
½Es=¼λ,
2Es=λ;
Et=2λ，存在
干扰作用！
2015年：
λB=2λ，无
干扰作用！但
实际可能存在
抑制干扰作用。

平行 管数	溶液C（Es）
2λ	λ	½λ	¼λ
1	＋	-	-	－
2	＋	-	-	－
3	＋	-	-	－
4	＋	-	-	－
平行 管数	溶液B（Et）
SE2λ	SEλ	SE½λ	SE¼λ
1	＋	+	+	－
2	＋	+	+	－
3	＋	+	+	－
4	＋	+	+	－

不符合2010年版要求，但符合2015年版要求
表c
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2010年：
Es=2λ;
½Es=λ,
2Es=4λ;
Et=½λ，存
在干扰作用！
2015年：
λB=½λ，无
干扰作用！但
实际可能存在
增强干扰作用。

平行 管数	溶液C（Es）
2λ	λ	½λ	¼λ
1	＋	＋	＋	－
2	＋	＋	＋	－
3	＋	＋	＋	－
4	＋	＋	＋	－
平行 管数	溶液B（Et）
SE2λ	SEλ	SE½λ	SE¼λ
1	＋	＋	＋	＋
2	＋	＋	＋	－
3	＋	＋	＋	－
4	＋	＋	＋	－

2010年版无法判断，不符合2015年版要求
表d
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2010年：
Es=½λ;
½Es=¼λ,
2Es=λ;
Et≤0.42λ，无
法判断！
2015年：
λB≤0.42λ，
存在干扰作用！
凝胶法干扰试验结果判断方法
2010年版的判断方法存在：
干扰
无干扰
无法判断
2015年版，避免了无法判断的情况，但
是可能存在误判的情况！需要谨慎对待
判断结果，出现表b和表c的结果应调整
试验条件，重新试验。
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凝胶半定量试验
结果判断方法
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2010年版
系列溶液A中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以λ，
为每个系列的反应终点浓度，所有平行管反应终点浓
度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度〔按公
式CE=antilg（∑X/2）〕。
若内毒素浓度小于规定的限值，判定供试品符合规
定。若内毒素浓度大于或等于规定的限值，判定供试
品不符合规定。
结果判断方法
2015年版
系列溶液A中每一系列的终点稀释倍数乘以λ，为每
个系列的反应终点浓度， 如果检验的是稀释过的供试
品，则将终点浓度乘以供试品进行半定量试验的初始
稀释倍数，即得到每一系列的内毒素浓度C。
若每一系列内毒素浓度均小于规定的限值，判定供试
品符合规定。每一系列内毒素浓度的几何平均值即为
供试品溶液的内毒素浓度〔按公式CE=antilg
（ ∑C/2） 〕。
若任何系列内毒素浓度不小于规定的限值，则判定
供试品不符合规定。
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结果判断方法
• 2010年版：将溶液A中的两个平行管反
应终点浓度的几何平均值与限值进行比
较，几何平均值大于限值则判定为不符
合规定。
• 2015年版： 将溶液A中的两个平行管反
应终点浓度分别与限值比较，当两个平
行结果中有任何大于限值时判定为不符
合规定。
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结果判断方法

供试品	D	MV D	反应终点 浓度
结果	+	+	+	+- ≥L 1/2L

1/8MVD 1/4MVD 1/2MV
+
+
+
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2010年版：
CE≥0.707L，无法判断！
2015年版：
其中有一管≥L，不符合规定。