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细菌鉴定中常用的生化反应试验
山东拓普生物工程有限公司
Shandong Tuopu Biol-Engineering Co.,Ltd
一.原理
由于不同的微生物具有不同的酶系,其新陈代谢类型不同,所以对各种物质利用后所产生的代谢产物也不同,可以用化学反应来测试微生物的代谢产物,这种反应称为生化反应。生化反应常用来鉴别在形态或其它方面不易区别的微生物,例如肠道细菌中,大肠杆菌和伤寒杆菌,二者在形态上不易区分,但前者能发酵乳糖,后者不能,因为可以根据能否发酵乳糖来区别它们,所以微生物的生化反应是
1.糖发酵试验 糖发酵试验是最常用的生化反应,绝大多数微生物都能利用糖类,但不同微生物对不同糖类的利用是有选择的,并且分解能力也不同,有些微生物能使糖分解产酸产气,有的只能产酸而不产气,酸和气的产生与否,可由试管中指示剂颜色的变化和小套管内气泡的有无来判断。指示剂溴香草酚蓝,在碱性环境呈蓝色,在酸性环境呈黄色,其操作如下:
在两种不同的糖发酵培养基中各接入菌种一环,然后置于37度的培养箱中培养24小时后,观察是否产酸、产气,并作空白对照。
2.甲基红试验(M.R试验) 某些细菌在葡萄糖蛋白胨培养基中能产生大量的酸,使PH值降低至4-5,它先产生丙酮酸、丙酮酸再分解成甲酸、乙酸、乳酸等。酸的产生可由加入甲基红指示剂的变色而指示。由于不同的细菌产酸量不同,如果培养液由原来的桔黄色变为鲜红色,即为甲基红的阳性反应,桔红色为阳性,黄色为阴性,操作如下:在葡萄糖蛋白胨水培养基中接入菌种一环,然后置37度培养48小时,在比色瓷小窝中倒入少许培养液,再滴入甲基红指示剂,观察结果。
3.V. P 试验 在葡萄糖蛋白胨水培养基中接入菌种,于37度培养24小时。在培养液里加入1/2培养液量的40%KOH,再加入等量的5%α-萘酚溶液,拨去棉塞,用力振荡,再放入37度温箱中保温15-30分钟。如培养液出现红色为阴性。
4.吲哚试验 在蛋白胨培养基中接入菌种一环,置37度培养箱中培养48小时,于培养液中缓慢加入5滴吲哚试剂,轻轻摇匀,静置观察,液面呈红色者为阳性,否则为阴性。
5.硝酸盐还原试验 在硝酸盐液体中各接入菌种一环,置37度培养2-4天,取两支干净的空试管或在比色瓷盘小窝中倒入少许培养液,再加入格里斯试剂A和B液各一滴,摇匀,观察结果,阳性者立即或于10分钟内显示红色,如为阴性者则有两种可能: 1)细菌不能还原硝酸盐;
2)细菌继续将亚硝酸分解成氨和氮。
6.产硫化氢试验 取H2S试验用培养基,用穿刺法接种,置37度培养24小时,观察有无黑色沉淀产生。 7.柠檬酸盐利用试验 取柠檬酸盐斜面培养基,划线接种,于37度培养2-4天后观察,培养基由绿色变为蓝色者为阳性,否则为阴性。
8.明胶液化试验 用穿刺的方法接种明胶培养基,于20度培养2-5天,取出观察明胶液化的情况及液化形状。
9.淀粉水解试验 将淀粉培养基融化后,倒平板。用接种环取苏云杆菌一环在平板的一边划“+”字接种,另取试验菌于另一边接种,置37度培养1天。观察,滴加碘液于培养基上,轻轻旋转培养皿,使碘液均匀铺满整个平板,如果在菌落周围出现无色透明圈,则淀粉被分解。透明圈大小说明该菌水解淀粉能力的大小。
细菌的新陈代谢都是在各种不同酶的催化下进行的,由于不同细菌的酶系统不同,其对营养物质的分解能力亦有差异,代谢产物亦不相同。故可利用生化反应的方法,测定细菌的各种代谢产物,借以区别和鉴定细菌。
一、单糖发酵试验
不同细菌具有发酵不同糖类的酶,因而分解糖类的能力各不相同。有的能分解某些糖产酸,有的则既能产酸又能产气,有的则不能分解,据此可以鉴别细菌。常用的糖(醇)有葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖等。
【材料】
1、菌种:大肠杆菌、伤寒杆菌18-24小时琼脂斜面培养物。
2、培养基:乳糖、葡萄糖液体发酵管。
【方法】
1、将大肠杆菌、伤寒杆菌分别以穿刺法接种于乳糖及葡萄糖发酵管中,经37℃孵育18-24小时后观察结果。
2、如细菌生长,则培养基变混浊;糖是否被分解,根据以下现象判定:
(1)指示剂仍为紫色不变,表示细菌不分解该糖,用“-”表示;
(2)指示剂由紫变黄,无气体产生,表示细菌分解该糖,产酸不产气,用“+”表示;
(3)指示剂由紫变黄,并有气体产生,表示细菌分解该糖,产酸又产气,用“⊕”表示。
注:液体单糖发酵管是在无糖肉汤或蛋白胨水中加入1%糖类,指示剂常用溴甲酚紫,pH感应界为5.6-6.6,色调由黄→紫。
【结果】 葡萄糖 乳糖
大肠杆菌 ⊕ ⊕
伤寒杆菌 + -
二、吲哚(靛基质)试验
某些细菌具有色氨酸酶,能分解蛋白胨中的色氨酸而生成吲哚(靛基质)。吲哚本身无色,不能直接观察,如与吲哚试剂中的对二甲基氨基苯甲醛作用,形成红色的玫瑰吲哚,即为吲哚试验阳性。本试验常用于鉴别某些肠道杆菌。
【材料】
1、菌种:大肠杆菌、产气杆菌琼脂斜面18-24小时培养物。
2、培养基:蛋白胨水培养基。
3、吲哚试剂。
【方法】
1、分别接种大肠杆菌、产气杆菌于2支蛋白胨水培养基中。
2、37℃孵育24-48小时后取出,沿管壁加入2-3滴吲哚试剂于液面上,振摇试管使试剂与培养液混合,然后静置数分种,观看是否变色。阳性者可见上层试剂呈玫瑰红色,仍呈黄色者为阴性。
【结果】 大肠杆菌 +, 产生杆菌 -
三、硫化氢试验:
某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸(如胱氨酸、半胱氨酸)生成H2So
产生的H2S遇培养基中的铅或铁离子,则形成黑褐色的硫化铅或硫化铁沉淀,黑褐色沉淀物越多,表示生成的H2S量越多,因此可间接地检测细菌是否产生H2S。
【材料】
1、菌种:大肠杆菌、变形杆菌18-24小时斜面培养物。
2、培养基:醋酸铅培养基。
【方法】
1、分别穿刺接种大肠杆菌、变形杆菌于2支醋酸铅培养基内。
2、37℃孵育24小时后观察,穿刺部位呈黑褐色者为阳性,不变颜色者为阴性。
【结果】大肠杆菌 -,变形杆菌 +
四、尿素酶试验
某些细菌如变形杆菌具有尿素酶,因此,在含有尿素的培养基中,能分解尿素产生氨,使培养基变碱,此时培养基中的酚红指示剂显红色,借此可鉴别细菌。
【材料】
1、菌种:大肠杆菌、变形杆菌的18~24小时斜面培养物。
2、培养基:尿素培养基。
【方法】
1、分别将大肠杆菌、变形杆菌接种于两支尿素培养基上。
2、37℃孵育24小时观察结果,尿素培养基变红色者为阳性,颜色不变为阴性。
【结果】大肠杆菌 -,变形杆菌 +
五、细菌色素的产生:
【材料】普通琼脂平板,绿脓杆菌,金黄色葡萄球菌
【方法】将绿脓杆菌,金黄色葡萄球菌分别接种于普通琼脂平板上,经37℃24小时孵育后,观察结果。
注意菌落颜色及周围培养基的颜色。
生物分类鉴定的重要依据之一。
二.内容和步骤