GB 4789.32-2002 食品卫生微生物学检验 大肠菌群的快速检测

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山东拓普生物工程有限公司

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ICS 07.100.30
C 53
中华人民共和国国家标准
GB/T 4789.32—2002
食品卫生微生物学检验
大肠菌群的快速检测
Microbiological examination of food hygiene—
Rapid detection of Coliform bacteria
2002-06-13发布  2002-10-01 实施
国家质量监督检验检疫总局
发布
GB/T 4789.32—2002
I
前 言
本标准规定了食品中大肠菌群的快速检验方法。本标准规定使用的培养基MUGal肉汤中的 4-甲基
伞型酮-β-D-半乳糖苷与美国联邦法规 40，第 141节，21 款(Code of Federal Regul ati ons 40, Part
141.21)规定的检验大肠菌群所用的MI 琼脂的主要成分(4-甲基伞型酮-β-D-半乳糖苷)是同一物质。
本标准关于大肠菌群的菌落计数，参考了I SO 4832: 1999(E)《微生物学-大肠菌群菌落计数法通则》
(Microbi ol ogy-General Gui dance for the enumerati on of col i forms-colony count technique)。
本标准中的附录 A是规范性附录。
本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。
本标准主要起草单位：镇江出入境检验检疫局，中国标准化协会，镇江质量技术监督局。
本标准主要起草人：甄宏太、李平、张秀春、闵继福。
GB/T 4789.32—2002
II
引 言
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸或醛，并产生β-半乳糖苷酶需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无
芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有
否污染肠道致病菌的可能。如果大肠菌群存在于食品中，表明未做有效的消毒处理、加工后保存条件不
良或消毒后又受到污染。快速检验这些细菌，有助于食品的卫生管理，维护消费者的食用安全。
GB/T 4789.32—2002
1
食品卫生微生物学检验
大肠菌群的快速检测
1 范围
本标准规定了食品中大肠菌群的快速检验和计数方法。
本标准适用于食品中大肠菌群的快速检验和计数。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的
修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究
是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB 4789.3 食品微生物学检验 大肠菌群测定
GB 4789.28 食品微生物学检验 染色法培养基和试剂
I SO 4832: 1991(E) 微生物学-大肠菌群菌落计数法通则
3 术语和定义
下列属于和定义适用于本标准
3.1
3.2 大肠菌群 Colifrom bacteria
大肠菌群是革兰氏阴性、无芽孢、氧化酶阴性的杆状细菌，为需氧和兼性厌氧，可在有胆盐（或具
有其他抑制生长的表面活性剂）存在的情况下生长，通常可在36℃±2℃发酵乳糖并产酸和醛。具有β-
半乳糖苷酶。在本标准设定的条件下，大肠菌群为能分解β-半乳糖苷，使培养基发出荧光或生成紫色
（或红色）菌落的一群革兰氏阴性无芽孢杆菌。
4 原理
4.1 最可能数(MPN)法
大肠菌群可产生β-半乳糖苷酶，分解液体培养集中的酶底物——4-甲基伞型酮-β-D-半乳糖苷（以
下简称MUGal）,使4-甲基伞型酮游离，因而在366nm的紫外光灯下呈现蓝色荧光。
4.2 平板法
大肠菌群可产生β-半乳糖苷酶，分解培养集中的酶底物--茜素-β-D半乳糖苷（以下简称Al iz-gal ）,
使茜素游离并与固体培养基中的铝、钾、铁、铵离子结合形成紫色（或红色）的螯合物，使菌落呈现相
应的颜色。
5 试剂和培养基
5.1 磷酸盐缓冲液
按 GB 4789.28-1994 中3.22规定进行制备。
5.2 生理盐水
5.2.1 成分
氯化钠 8.5g
GB/T 4789.32—2002
2
蒸馏水 1 000mL
5.2.2 制法
将氯化钠溶于蒸馏水，121℃蒸汽灭菌15mi n。
5.3 MUGal肉汤
5.3.1 成分
胰蛋白胨或胰酪胨  20.0g
氯化钠 5.0g
无水磷酸氢二钾 2.75g
无水磷酸二氢钾 2.75g
月桂基硫酸钠  0.1g
MUGal (纯度不低于99%)  0.08g
蒸馏水 1 000mL
5.3.2 制法
将各成分加热溶于蒸馏水中，以 15％～20％氢氧化钠溶液调整 pH 值，分装于 20 mm×150 mm试
管，每管 9 mL，116℃蒸汽灭菌10 min，最终pH值7.0～7.2。待培养基冷却后，以无菌手续于每管培养
液内加入 0.1 mL 经无菌水稀释的 500 μg/mL 头孢磺定液或于 1000mL 灭菌培养液内加 1 mL经无菌
水稀释的5 mg/mL头孢磺啶液并以无菌操作分装试管。
注： 双料的MUGal 肉汤除蒸馏水外其他成分加倍
5.4 Aliz-gal琼脂
5.4.1 成分
胰蛋白胨或胰酪胨  20.0g
氯化钠 5.0g
无水磷酸氢二钾 2.75g
无水磷酸二氢钾 2.75g
月桂基硫酸钠  0.1g
Al iz-gal （纯度不低于97%）  0.05g
异丙基硫代半乳糖苷 0.03g
硫酸铝钾  0.5g
柠檬酸铁铵 0.5g
琼脂  15.0g
蒸馏水 1 000mL
5.4.2 制法
将各成分放入蒸馏水中，加热使溶化，以15％～20％ NaOH 调整pH值，分装烧瓶，116℃蒸汽灭菌
10mi n，最终pH值 7.0～7.2。
6 设备和器材
6.1 培养箱：37 ℃ ± 1℃。
6.2 冷藏箱：0 ℃ ± 4℃。
6.3 天平：感量 0.01g。
6.4 均质器或乳钵。
6.5 平皿：直径90mm。
6.6 试管：20mm x 150 mm。
6.7 吸管：1.0mL 和 10.0mL。
GB/T 4789.32—2002
3
6.8 广口瓶或三角瓶：容量 500mL。
6.9 玻璃珠：直径约5mm。
6.10 试管架。
6.11 紫外灯（波长 366nm）。
6.12 其他。
7 检验程序
见图1。
图1 检验程序
8 样品的制备
8.1 以无菌手续取 25mL（或 25g）样品，加于含225 mL 无菌磷酸盐缓冲液（或生理盐水）的广口瓶（或
三角瓶）内（瓶内预置适当数量的玻璃珠），充分振摇或用均质器以 8 000 r/m～10 000 r/m均质1 mi n
成 1∶10稀释液。
8.2 用1mL 无菌吸管吸取 1∶10 样品稀释液 1.0mL，注入含 9.0 mL 无菌磷酸盐缓冲液（或生理盐水）
的试管内。振摇均匀，即成 1∶100 样品稀释液。
8.3 另取 1.0 mL无菌吸管，按上法制备 10倍递增样品稀释液。每递增一次，换一支 1.0 mL 无菌吸管。
8.4 根据食品卫生标准要求或对样品污染程度的估计，选择三个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种
三管培养基（MPN法）或两个平皿（平板法）。
9 大肠菌群的 MPN 计数
9.1 将待检样品和样品稀释液接种MUGal 肉汤管，每管1.0 mL(接种量在1.0 mL以上者，接种双料MUGal
肉汤管)，每个样品接种三个连续稀释度，每个稀释度接种 3 管培养基。同时另取 2 支 MUGal 肉汤管（或
双料 MUGal 肉汤管）加入与样品稀释液等量的上述无菌磷酸盐缓冲液（或生理盐水）作空白对照。
9.2 将接种后的培养管置于 37 ℃ ± 1℃ 培养箱培养 18～24h。
检样
稀释
在波长 366nm 紫外灯
下置暗处观察
Aliz-gal 琼脂(平板法)
37 ℃ ± 1℃ 18~24h
计数紫色(或红色)菌落
报告
有荧光  无荧光
MUGal 肉汤(MPN 法)
37 ℃ ± 1℃ 18~24h
大肠菌群阴性  大肠菌群阳性
报告  报告
GB/T 4789.32—2002
4
9.3 将培养管置于暗处，用波长 366nm的紫外光灯照射，如显蓝色荧光，为大肠菌群阳性管；如未显
蓝色荧光，则为大肠菌群阴性管。
9.4 结果报告：根据大肠菌群阳性管数，查MPN表（见附录 A）,报告每 100mL（g）食品中大肠菌群
MPN值。
10 大肠菌群的菌落计数
10.1 用灭菌吸管吸取待检样液 1.0mL，加入无菌平皿内。每个样品接种三个连续稀释度，每个稀释度
接种两个平皿。
10.2 于每个加样平皿内倾注 15mL 45℃～50℃ 的 Al iz-gal 琼脂，迅速轻轻转动平皿，使混合均匀。
待琼脂凝固后，再倾注 3mL～5mL Al i z-gal 琼脂覆盖表面。同时将 Al i z-gal 琼脂倾入加有 1mL 上述无
菌磷酸盐缓冲液（或生理盐水）的无菌平皿内作空白对照。
10.3 待琼脂凝固后，翻转平板，于 37 ℃ ± 1℃ 培养箱培养18～24h。取出平板，计数紫色（或红
色）菌落。
10.4 结果报告
10.4.1 当平板上的紫色（或红色）菌落数不高于 150 个，且其中至少有一个平板紫色（或红色）菌落
不少于 15 个时，按式（1）计算大肠菌群数：
d n n
C
N
) 2 1 ( +
∑
=
⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯（1）
式中：
N——样品的大肠菌群数，个/mL或g；
∑C——所有计数平板上，紫色（或红色）菌落数之总和；
n1——供计数的最低稀释倍数的平板数；
n2——供计数的高一倍数的平板数；
d——供计数的样品最低稀释度（如10
-1 , 10 -2 , 10 -3 等）。
10.4.2 如接种所有（3 个）稀释样品的平板上紫色（或红色）菌落数均少于 15个时，仍按式（1）计
算，但应在所得结果旁加“*”号，表示为估计值。
10.4.3 如接种未稀释样品和所有稀释样品的平板上，紫色（或红色）菌落数均少于 15 个时，报告结
果为：每毫升（克）样品少于 15 个大肠菌群。
10.4.4 如接种未稀释样品和所有稀释样品的平板上，均未发现紫色（或红色）菌落数时，报告结果为：
每毫升（克）样品少于 1 个大肠菌群。
10.4.5 如平板上的紫色（或红色）菌落数高于 150个时，按式(1)计算，在结果旁加“*”号表示估计
值或视情况重新选择较高的稀释倍数进行测定。
GB/T 4789.32—2002
5
附 录 A
（规范性附录）
大肠菌群最可能数(MPN)检索表
表 A.1
阳性管数  95%可信限
1 mL(g)x3  0.1mL(g) x 3  0.01mL(g)x3
MPN 100 mL(g)
下限  上限
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
2
3
<30
30
60
90
＜5  90
0
0
0
0
1
1
1
1
0
1
2
3
30
60
90
120
＜5  130
0
0
0
0
2
2
2
2
0
1
2
3
60
90
120
160
-  -
0
0
0
0
3
3
3
3
0
1
2
3
90
130
160
190
-  -
1
1
1
1
0
0
0
0
0
1
2
3
40
70
110
150
＜5
10
200
210
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
2
3
70
110
150
190
10
30
200
210
1
1
1
1
2
2
2
2
0
1
2
3
110
150
200
240
30  360
1
1
1
1
3
3
3
3
0
1
2
3
160
200
240
290
-  -
2
2
2
2
0
0
0
0
0
1
2
3
90
140
200
260
10
30
360
370
GB/T 4789.32—2002
6
表 A.1（续）
阳性管数  95%可信限
1 mL(g)x3  0.1mL(g) x 3  0.01mL(g)x3
MPN 100 mL(g)
下限  上限
2
2
2
2
1
1
1
1
0
1
2
3
150
200
270
340
30
70
440
890
2
2
2
2
2
2
2
2
0
1
2
3
210
280
350
420
40
100
470
1 500
2
2
2
2
3
3
3
3
0
1
2
3
290
360
440
530
-  -
3
3
3
3
0
0
0
0
0
1
2
3
230
390
640
950
40
70
150
1 200
1 300
3 800
3
3
3
3
1
1
1
1
0
1
2
3
430
750
1 200
1 600
70
140
300
2 100
2 300
3 800
3
3
3
3
2
2
2
2
0
1
2
3
930
1 500
2 100
2 900
150
300
350
3 800
4 400
4 700
3
3
3
3
3
3
3
3
0
1
2
3
2 400
4 600
11 000
≥24 000
360
710
1 500
13 000
24 000
48 000
注 1：本表采用 3 个稀释度[ 1mL(g)、0.1mL(g)和0.01mL(g)], 每稀释度 3管。
注 2：表内所列检样量如改用 10mL(g)、1mL(g)和 0.1mL(g)时，表内数字相应降低 10 倍；如改用0.1mL(g)、
0.01mL(g)和 0.001mL(g)时，则表内数字应相应增加 10 倍，其余可类推。