GB 4789.3-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数

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Shandong Tuopu Biol-Engineering Co.,Ltd

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准
GB4789. 3 — 2016
食品安全国家标准
食品微生物学检验 大肠菌群计数
2016-12-23 发布 2017-06-23 实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局
发 布
GB4789. 3 — 2016
Ⅰ
前 言
本标准代替 GB4789.3 — 2010 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠 菌群计数》、
GB / T4789. 32 — 2002 《食品卫生微生物学检验 大肠菌群的快速检测》和 SN / T0169 — 2010 《进出口
食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法》大肠菌群计数部分。
本标准与 GB4789.
3 — 2010 相比,主要变化如下:
———增加了检验原理;
———修改了适用范围;
———修改了典型菌落的形态描述;
———修改了第二法平板菌落数的选择;
———修改了第二法证实试验;
———修改了第二法平板计数的报告。
GB4789. 3 — 2016
1
食品安全国家标准
食品微生物学检验 大肠菌群计数
1  范围
本标准规定了食品中大肠菌群(
Coliforms )计数的方法。
本标准第一法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数;第二法适用于大肠菌群含量较
高的食品中大肠菌群的计数。
2  术语和定义
2. 1
大肠菌群 Coliforms
在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2. 2
最可能数 Mostprobablenumber ; MPN
基于泊松分布的一种间接计数方法。
3  检验原理
3. 1 MPN 法
MPN 法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后,根据其未
生长的最低稀释度与生长的最高稀释度,应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。
3. 2  平板计数法
大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸,在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色,带有或不带
有沉淀环的菌落。
4  设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
4. 1  恒温培养箱: 36℃ ±1℃ 。
4. 2  冰箱: 2℃~5℃ 。
4. 3  恒温水浴箱: 46℃±1℃ 。
4. 4  天平:感量 0. 1g 。
4. 5  均质器。
4. 6  振荡器。
4. 7  无菌吸管: 1mL (具 0. 01mL 刻度)、 10mL (具 0. 1mL 刻度)或微量移液器及吸头。
4. 8  无菌锥形瓶:容量 500mL 。
4. 9  无菌培养皿:直径 90mm 。
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4. 10 pH 计或
pH
比色管或精密
pH 试纸。
4. 11  菌落计数器。
5  培养基和试剂
5. 1  月桂基硫酸盐胰蛋白胨( laurylsulfatetryptose , LST )肉汤:见 A. 1 。
5. 2  煌绿乳糖胆盐( brilliantgreenlactosebile , BGLB )肉汤:见 A. 2 。
5. 3  结晶紫中性红胆盐琼脂( violetredbileagar , VRBA ):见 A. 3 。
5. 4  无菌磷酸盐缓冲液:见 A. 4 。
5. 5  无菌生理盐水:见 A. 5 。
5. 6 1mol
/ LNaOH 溶液:见 A.
6 。
5. 7 1mol
/ LHCl 溶液:见 A.
7 。
第一法 大肠菌群 MPN 计数法
6  检验程序
大肠菌群 MPN 计数的检验程序见图 1 。
图 1  大肠菌群 MPN 计数法检验程序
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7  操作步骤
7. 1  样品的稀释
7. 1. 1  固体和半固体样品:称取 25g 样品,放入盛有 225mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯
内 ,
8000r / min~10000r / min 均质 1min~2min ,或放入盛有 225mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无
菌均质袋中,用拍击式均质器拍打 1min~2min ,制成 1∶10 的样品匀液。
7. 1. 2  液体样品:以无菌吸管吸取 25mL 样品置盛有 225mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶
(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇,充分混匀,制
成 1∶10 的样品匀液。
7. 1. 3  样品匀液的
pH
应在 6.
5~7. 5 之间,必要时分别用 1mol
/ LNaOH 或 1mol / LHCl 调节。
7. 1. 4  用 1mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1∶10 样品匀液 1mL ,沿管壁缓缓注入 9mL 磷酸盐缓冲
液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用 1 支 1mL 无
菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成 1∶100 的样品匀液。
7. 1. 5  根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释
1 次,换用 1 支 1mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过 15min 。
7. 2  初发酵试验
每个样品,选择 3 个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种 3 管
月桂基硫酸盐胰蛋白胨(
LST )肉汤,每管接种 1mL (如接种量超过 1mL ,则用双料 LST 肉汤), 36℃±
1℃ 培养 24h±2h ,观察倒管内是否有气泡产生, 24h±2h 产气者进行复发酵试验(证实试验),如未
产气则继续培养至 48h±2h ,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。
7. 3  复发酵试验(证实试验)
用接种环从产气的 LST 肉汤管中分别取培养物 1 环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤( BGLB )管中,
36℃±1℃ 培养 48h±2h ,观察产气情况。产气者,计为大肠菌群阳性管。
7. 4  大肠菌群最可能数( MPN )的报告
按 7.
3 确证的大肠菌群 BGLB 阳性管数,检索 MPN 表(见附录 B ),报告每 g ( mL )样品中大肠菌群
的 MPN 值。
第二法 大肠菌群平板计数法
8  检验程序
大肠菌群平板计数法的检验程序见图 2 。
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图 2  大肠菌群平板计数法检验程序
9  操作步骤
9. 1  样品的稀释
按 7.
1 进行。
9. 2  平板计数
9. 2. 1  选取 2 个 ~3 个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种 2 个无菌平皿,每皿 1mL 。同时取 1mL
生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
9. 2. 2  及时将 15mL~20mL 融化并恒温至 46℃ 的结晶紫中性红胆盐琼脂( VRBA )约倾注于每个平
皿中。小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀,待琼脂凝固后,再加 3mL~4mLVRBA 覆盖平板表
层。翻转平板,置于 36℃±1℃ 培养 18h~24h 。
9. 3  平板菌落数的选择
选取菌落数在 15CFU~150CFU 之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落
(如菌落直径较典型菌落小)。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为 0.
5mm
或更大,最低稀释度平板低于 15CFU 的记录具体菌落数。
9. 4  证实试验
从 VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型和可疑菌落,少于 10 个菌落的挑取全部典型和可疑菌
落。分别移种于 BGLB 肉汤管内, 36℃±1℃ 培养 24h~48h ,观察产气情况。凡 BGLB 肉汤管产气,
即可报告为大肠菌群阳性。
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9. 5  大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以 9.
3 中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每
g ( mL )样品中大肠菌群数。例: 10
-4 样品稀释液 1mL ,在
VRBA 平板上有 100 个典型和可疑菌落,挑
取其中 10 个接种 BGLB 肉汤管,证实有 6 个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:
100×6 / 10×10
4 /
g ( mL ) =
6. 0×10
5 CFU
/ g ( mL )。若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于 1 乘以最低稀
释倍数计算。
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附 录 A
培养基和试剂
A. 1  月桂基硫酸盐胰蛋白胨( LST )肉汤
A. 1. 1  成分
胰蛋白胨或胰酪胨
20. 0g
氯化钠
5. 0g
乳糖
5. 0g
磷酸氢二钾( K
2 HPO 4 ) 2. 75g
磷酸二氢钾( KH 2 PO 4 )
2. 75g
月桂基硫酸钠
0. 1g
蒸馏水
1000mL
A. 1. 2  制法
将上述成分溶解于蒸馏水中,调节
pH
至 6.
8±0. 2 。分装到有玻璃小倒管的试管中,每管 10mL 。
121℃ 高压灭菌 15min 。
A. 2  煌绿乳糖胆盐( BGLB )肉汤
A. 2. 1  成分
蛋白胨
10. 0g
乳糖
10. 0g
牛胆粉( oxgall 或 oxbile )溶液
200mL
0. 1% 煌绿水溶液 13. 3mL
蒸馏水
800mL
A. 2. 2  制法
将蛋白胨、乳糖溶于约 500mL 蒸馏水中,加入牛胆粉溶液 200mL (将 20.
0g 脱水牛胆粉溶于
200mL 蒸馏水中,调节
pH
至 7.
0~7. 5 ),用蒸馏水稀释到 975mL ,调节
pH
至 7.
2±0. 1 ,再加入 0. 1%
煌绿水溶液 13.
3mL ,用蒸馏水补足到 1000mL ,用棉花过滤后,分装到有玻璃小倒管的试管中,每管
10mL 。 121℃ 高压灭菌 15min 。
A. 3  结晶紫中性红胆盐琼脂( VRBA )
A. 3. 1  成分
蛋白胨
7. 0g
酵母膏
3. 0g
乳糖
10. 0g
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7
氯化钠
5. 0g
胆盐或 3 号胆盐
1. 5g
中性红
0. 03g
结晶紫
0. 002g
琼脂
15g~18g
蒸馏水
1000mL
A. 3. 2  制法
将上述成分溶于蒸馏水中,静置几分钟,充分搅拌,调节
pH
至 7.
4±0. 1 。煮沸 2min ,将培养基融
化并恒温至 45℃~50℃ 倾注平板。使用前临时制备,不得超过 3h 。
A. 4  磷酸盐缓冲液
A. 4. 1  成分
磷酸二氢钾( KH 2 PO 4 )
34. 0g
蒸馏水
500mL
A. 4. 2  制法
贮存液:称取 34.
0g 的磷酸二氢钾溶于 500mL 蒸馏水中,用大约 175mL
的 1mol / L 氢氧化钠溶
液调节
pH
至 7.
2±0. 2 ,用蒸馏水稀释至 1000mL 后贮存于冰箱。稀释液:取贮存液 1. 25mL ,用蒸馏
水稀释至 1000mL ,分装于适宜容器中, 121℃ 高压灭菌 15min 。
A. 5  无菌生理盐水
A. 5. 1  成分
氯化钠
8. 5g
蒸馏水
1000mL
A. 5. 2  制法
称取 8.
5g 氯化钠溶于 1000mL
蒸馏水中, 121℃ 高压灭菌 15min 。
A. 6 1mol
/ LNaOH 溶液
A. 6. 1  成分
NaOH 40. 0g
蒸馏水
1000mL
A. 6. 2  制法
称取 40g 氢氧化钠溶于 1000mL 无菌蒸馏水中。
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A. 7 1mol
/ LHCl 溶液
A. 7. 1  成分
HCl 90mL
蒸馏水
1000mL
A. 7. 2  制法
移取浓盐酸 90mL ,用无菌蒸馏水稀释至 1000mL 。
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附 录 B
大肠菌群最可能数( MPN )检索表
B. 1  大肠菌群最可能数( MPN )检索表
每 g ( mL )检样中大肠菌群最可能数( MPN )的检索见表 B.
1 。
表 B.
1  大肠菌群最可能数( MPN )检索表
阳性管数
0. 10 0. 01 0. 001
MPN
95% 可信限
下限 上限
阳性管数
0. 10 0. 01 0. 001
MPN
95% 可信限
下限 上限
0 0 0 <3. 0
—
9. 5 2 2 0 21 4. 5 42
0 0 1 3. 0 0. 15 9. 6 2 2 1 28 8. 7 94
0 1 0 3. 0 0. 15 11 2 2 2 35 8. 7 94
0 1 1 6. 1 1. 2 18 2 3 0 29 8. 7 94
0 2 0 6. 2 1. 2 18 2 3 1 36 8. 7 94
0 3 0 9. 4 3. 6 38 3 0 0 23 4. 6 94
1 0 0 3. 6 0. 17 18 3 0 1 38 8. 7 110
1 0 1 7. 2 1. 3 18 3 0 2 64 17 180
1 0 2 11 3. 6 38 3 1 0 43 9 180
1 1 0 7. 4 1. 3 20 3 1 1 75 17 200
1 1 1 11 3. 6 38 3 1 2 120 37 420
1 2 0 11 3. 6 42 3 1 3 160 40 420
1 2 1 15 4. 5 42 3 2 0 93 18 420
1 3 0 16 4. 5 42 3 2 1 150 37 420
2 0 0 9. 2 1. 4 38 3 2 2 210 40 430
2 0 1 14 3. 6 42 3 2 3 290 90 1000
2 0 2 20 4. 5 42 3 3 0 240 42 1000
2 1 0 15 3. 7 42 3 3 1 460 90 2000
2 1 1 20 4. 5 42 3 3 2 1100 180 4100
2 1 2 27 8. 7 94 3 3 3 >1100 420
—
注 1 :本表采用 3 个稀释度[ 0. 1g ( mL )、 0. 01g ( mL )、 0. 001g ( mL )],每个稀释度接种 3 管。
注 2 :表内所列检样量如改用 1g ( mL )、 0.
1g ( mL )和 0.
01g ( mL )时,表内数字应相应降低 10 倍;如改用 0.
01g
( mL )、
0. 001g ( mL )和 0. 0001g ( mL )时,则表内数字应相应增高 10 倍,其余类推。