[所属分类:新闻动态] [发布时间:2019-8-21] [发布人:] [阅读次数:] [返回]

山东拓普生物工程有限公司

Shandong Tuopu Biol-Engineering Co.,Ltd

基因编码的生物传感器能够特异性识别细胞内的小分子物质并转化为可识别的表型（如荧光信号等），通过结合高通量筛选装置建立相应的小分子物质高通量筛选技术，可以为挖掘和改造获得性能优异的生物菌种资源提供保障。因此，开发获得能够充分表征小分子物质（代谢物）的生物传感器模块具有重要意义。

中国科学院天津工业生物技术研究所研究员王钦宏带领的进化与代谢工程研究团队通过转录组辅助的代谢物感应（transcriptome-assisted metabolite-sensing，TAMES）策略，成功实现了3-脱氢莽草酸（3-dehydroshikimate，DHS）感应模块的发掘和应用。该策略基于目标代谢产物生产菌和非生产菌株之间的选择性比较转录组分析和随后的RT-qRCR评估，逐级缩小范围并有效鉴定出可响应目标代谢物的感应模块。研究人员利用该策略鉴定了代谢物DHS的感应模块CusR，进一步构建了基于CusR的生物传感器和基于该DHS生物传感器的高通量筛选平台，筛选获得多株高产DHS的菌株，将DHS产量提高了90％以上。该研究表明TAMES策略能有效挖掘获得感应特定代谢物的生物传感器，为开发其他小分子代谢物基于生物传感器的高通量筛选应用提供了借鉴。

生物传感器最新研究进展：转录组辅助的代谢物感应策略

该研究得到中科院科技服务网络计划(KFJ-SW-STS-165)、天津市科技计划项目(14ZCZDSY00066，15PTCYSY00020)、中科院重点部署项目(KFZD-SW-212-3-1)、国家科技重大专项(2017ZX09101003)的资助，研究成果已申请中国发明专利，相关成果发表在ACS synthetic biology，天津工生所硕士生李梁坡为论文第一作者，王钦宏和副研究员涂然为共同通讯作者。

多功能生物传感器，病菌分离、检测、杀灭“三合一”‍‍‍

细菌引起的感染是全球性的公众健康威胁，临床上一般需要有针对性地使用抗生素进行治疗，这就要求对病原菌的诊断快速、灵敏且准确。传统的病原菌检测方法包括：标准平板菌落计数、聚合酶链反应和免疫检测（例如酶联免疫吸附试验）等。不过，标准平板菌落计数法操作复杂且耗时，而后两种测试需要昂贵的专用设备，还需进行复杂的样品预处理，抗干扰能力不强。为了解决这些问题，开发分析时间更短、灵敏度和特异性更高的小型化生物传感器就成了研究热点。通过表面增强拉曼散射（surface-enhanced Raman scattering，SERS）来检测病原菌，可提供清晰、特异的细菌“指纹图谱”，从而可以轻松地区分复杂样品中不同种类的细菌，实现快速、灵敏和高效的细菌检测。SERS方法中，细菌的选择性捕获通常使用4-巯基苯硼酸（4-MPBA）、抗体、适配体、抗生素等，但它们的特异性、成本、稳定性等都或多或少存在不足。

近日，暨南大学江正瑾教授、周海波副教授和高昊教授等研究者在Chemical Science杂志报道了一种基于夹心结构的新型生物传感器，通过磁富集和SERS标签同时分离和检测多种细菌病原体。研究团队使用抗菌肽（antimicrobial peptide，AMP）修饰的Fe3O4磁性纳米粒子，作为“捕获”探针用于细菌的选择性分离和磁富集。此外，他们使用4-MPBA修饰的银包金-氧化石墨烯（Au Ag-GO）纳米复合物作为SERS标签，其中4-MPBA既是生物识别分子又是拉曼信号分子，可用作内标（IS）校正SERS强度。实验证明，这种新型生物传感器可成功分离并检测三种病原菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌），每种菌株的最低检测限仅为10 CFU/mL。有意思的是，AMP修饰的Fe3O4磁性纳米粒子具有高抗菌活性和低细胞毒性，可作为血液长期储存中的抗菌剂。更重要的，这种新方法可用于临床患者血液样本的检测，来自39名患者的真实血液样本中97.3%都可被有效分离和检测，只有一名感染大肠杆菌的患者出现了误判。这种多功能“三合一”生物传感器可以同时分离、检测和杀灭细菌，在临床诊断和输血安全保障等领域都有很好的应用前景。

这种新型生物传感器检测细菌的基础是形成“捕获探针/细菌/SERS标签”的夹心结构。AMP（本文用的是“杆菌肽A”）修饰的Fe3O4纳米粒子作为捕获探针首先与含有细菌、血细胞和其他干扰物的样品一起培养，AMP修饰的Fe3O4纳米粒子与细菌特异性结合，并且通过外加磁场将细菌分离出来，而血细胞和其他干扰物都被除去（下图A-C）。随后，添加用4-MPBA修饰的Au Ag-GO纳米复合物作为SERS标签，其中4-MPBA既是生物识别分子又是拉曼信号分子，SERS标签即与Fe3O4纳米粒子/细菌形成夹心结构。通过磁分离可以进一步收集这种夹心结构，然后进行拉曼光谱分析（下图D-E）。在随后的SERS检测中，4-MPBA作为拉曼信号分子可提供强拉曼信号。当细菌结合到SERS标签上时，4-MPBA与不同种类细菌细胞壁之间发生识别相互作用，拉曼“指纹图谱”也会显示出相应的变化，这就可以区分不同种类的细菌（下图F）。此外，4-MPBA可用作内标（IS）校正SERS强度（下图G）。如此一来，这种创新性的SERS夹心策略就能够实现对病原菌的高灵敏检测和特异性鉴别。

“三合一”SERS生物传感器的操作过程示意图。图片来源：Chem.Sci.

研究团队制备了杆菌肽A修饰的Fe3O4磁性纳米粒子（捕获探针）和Au Ag-GO纳米复合物（SERS标签），并进行了相应的表征。研究者随后验证了用捕获探针和SERS标签检测细菌的可能性。在没有大肠杆菌的情况下，只能得到没有拉曼信号的Fe3O4磁性纳米粒子聚集体（下图A-B）；而大肠杆菌存在时，可以得到强拉曼信号的“捕获探针/细菌/SERS标签”的夹心结构（下图C-D）。这种夹心结构也通过透射电子显微镜（TEM）得到了验证（下图F），与细菌的电镜图像（下图E）差别十分明显。

对于分别含大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的样品，研究者对SERS结果进行了基于算法的判别分析（discriminant analysis，DA），发现不同的细菌具有不同的“指纹图谱”，完全可以进行分类和鉴别。而且，每种菌株的最低检测限仅为10 CFU/mL。与无标记（不含4-MPBA）SERS细菌检测的对比实验结果证明，4-MPBA可用作内标（IS）校正SERS强度，具有高重现性；同时4-MPBA也是拉曼信号分子，可提高检测灵敏度，放大细菌“指纹图谱”之间的差异。

为了验证这种新方法在临床检测上的实用性，研究者从暨南大学第一附属医院获取了39份全血样品并使用这种SERS生物传感器进行测试。实际血液样品复杂的成分并没有对检测结果产生明显的影响，39份样品中有38份的检测结果都与实际结果相符，仅有1份感染大肠杆菌的血样没有被正确检测出，准确率高达97.3%。此外，抗菌活性测试结果和鼠巨噬细胞的细胞毒性测试结果表明，所用的AMP修饰的Fe3O4磁性纳米粒子具有很好的抗菌活性，而且几乎没有观察到细胞毒性，这意味着其可以作为抗菌剂用于血液的长期储存。

暨南大学药学院的研究团队报道了一种基于“捕获探针/细菌/SERS标签”夹心结构的新型生物传感器。AMP功能化的Fe3O4磁性纳米粒子作为捕获探针用于细菌的选择性分离和磁富集，而4-MPBA修饰的银包金-氧化石墨烯（Au Ag-GO）纳米复合物作为SERS标签。4-MPBA一方面可以识别细菌，一方面可以作为信号分子产生强的拉曼信号，以4-MPBA为内标校正SERS强度，可提高重现性。无论是实验室内模拟样品的测试，还是真实患者血液样品的临床测试，这种生物传感器都能以很高的准确率区分多种病原菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌），菌株的最低浓度仅为10 CFU/mL。此外，AMP修饰的Fe3O4磁性纳米粒子还具有高抗菌活性和低细胞毒性，可作为抗菌剂用于血液长期储存。总之，这种多功能“三合一”生物传感器可以同时分离、检测和杀灭病原菌，很有希望应用于病原菌临床诊断和输血安全保障等领域。