治疗失明新方法

[所属分类:新闻动态] [发布时间:2019-11-11] [发布人:] [阅读次数:] [返回]

山东拓普生物工程有限公司

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韩国韩东国际大学（Handong Global University）和首尔国立大学医学院的研究人员发表了题为：CRISPR-Cas9–mediated therapeutic editing of Rpe65 ameliorates the disease phenotypes in a mouse model of Leber congenital amaurosis 的研究论文。在该研究中，研究人员通过视网膜下注射携带CRISPR-Cas9和供体DNA的AAV病毒在rd12小鼠（人类先天性黑蒙症模型）中对Rpe65中疾病相关的无义突变进行了CRISPR-Cas9介导的首次治疗性校正，并改善了视网膜功能，为开发先天性黑蒙症的治疗提供了新的视角。

CRISPR-Cas9技术在短短五年内风靡全球实验室， 成为了生物科学领域最炙手可热的研究工具， 可分别通过同源定向修复（HDR）或非同源末端连接（NHEJ）导致基因插入或突变、删除。虽然HDR的发生频率普遍低于NHEJ，但HDR永久纠正致病突变的能力对于治疗各种遗传疾病具有巨大的潜力。

为了使用CRISPR-Cas9技术来治疗先天性黑蒙症，研究人员首先使用了来自rd12小鼠的胚胎成纤维细胞（MEFs）来筛选针对Rpe65外显子3的单导RNA （sgRNA）序列，并最终确定了一个优化的sgRNA序列TS4 sgRNA进一步研究，因为它可以在离提前终止密码子最近的位点上产生双链断裂（DSB），并导致高效的插入或删除（indel）率。

为了评估CRISPR-Cas9介导的疾病模型中Rpe65无义突变编辑的治疗效果，研究人员更改了TS4中的一个核苷酸以设计TS4 rd12 sgRNA，该序列与rd12小鼠中Rpe65外显子3突变位点的序列完全匹配。将所有必需的编辑组件合并到两个单独的AAV中（AAV-SpCas9和AAV-TS4 rd12 sgRNA-Rpe65-供体，以下称为AAV-TS4 rd12-供体），并使用双AAV系统进行体内递送。研究人员通过改变其浓度来优化AAV组分的比例，以获得最大的基因组编辑结果，研究表明在视网膜下递送比在视网膜递送更有效，并且Cas9与sgRNA的比例对于优化编辑至关重要。

为了研究HDR介导的Rpe65基因校正对rd12小鼠的治疗效果，研究人员在视网膜下注射AAV后6周和7个月进行黑暗适应后进行了视网膜电图检查。AAV处理导致注射后6周视网膜色素上皮细胞中Rpe65表达的恢复。此外，AAV处理导致注射后7个月视网膜色素上皮细胞中Rpe65基因表达的增加。在视网膜电图中，在视网膜下注射后6周，AAV处理的rd12小鼠在黑暗适应后，对亮刺激（0 dB）产生了明确的响应。初次注射后，电反应可维持7个月，并且视网膜电图a波和b波分别恢复到了野生型小鼠的21.2±4.1%和39.8±3.2%。这些功能恢复伴随着解剖学改变，其中HDR介导的Rpe65基因校正阻止了rd12视网膜外核层神经元细胞的丢失。

为了全局表征TS4 rd12 sgRNA 识别的潜在脱靶位点，研究人员使用rd12小鼠的基因组DNA 进行了Digenome-seq，这是全基因组的无偏脱检测方法。该分析显示了几个潜在的脱靶位点。随后，研究人员使用靶向深度测序验证了前29个Digenome-seq潜在脱靶位点。在rd12小鼠的视网膜中，6个基因组位点被证实是TS4rd12 sgRNA的活性靶点，这些所有活跃的脱靶位点均位于内含子或基因间区域。在随后的脱靶分析中，与TS4 rd12 sgRNA序列相差最多三个核苷酸的所有33个同源位点，在AAV处理的rd12小鼠的预测基因组位点上未观察到有意义的indel突变。此外，在这些小鼠中7个月内没有组织学扰动或肿瘤发生。

总的来说，该研究提供了一种基于CRISPR-Cas9的新方法来治疗先天性黑蒙症。该研究称，以前的报道均未在眼科疾病动物模型中显示体内HDR介导的校正。该研究的永久性基因组编辑治疗方法可以单独使用，也可以与基因治疗或蛋白质治疗一起使用，以治疗先天性黑蒙症。